Cette recherche a été financée par le NIH subventions GM055360 de SLB et U54HD068157 de RGM. JMB a été pris en charge par la subvention de formation T32 génétique à l&#39;Université de Pennsylvanie (GM008216).

Le protocole STA-PUT comporte trois étapes: 1) Mise en place de l&#39;appareil et les réactifs, 2) Préparation de la suspension de cellules de testicules entiers, et 3) Cell, la sédimentation, et la collecte de fractions. Quand elle est réalisée par une équipe de deux chercheurs, le protocole faut huit heures en moyenne. Une. Mise en place du Dispositif STA-PUT (Figure 1) *** Appareil STA-PUT doit être placé dans un 4 ° C grand réfrigérateur ou une chambre froide qui peut également accueillir un collecteur de fraction, si ce mode de collecte est préférable. <ol><li> La nuit avant (ou au moins quelques heures avant), vous effectuez la méthode, laver tous les équipements (en particulier la verrerie et de tubes) et stériliser à l&#39;éthanol à 70%. Laissez sécher le matériel avant le montage de l&#39;appareil, comme illustré à la figure 1. </li><li> Fixez les deux cylindres 2 L (figures 1B et C) et la chambre cellule de chargement ( <strong&gt; Figure 1A) à la plate-forme supérieure et relier le tout avec deux petits morceaux de tube avec colliers de serrage. Fixez tous les tubes fermés. Sceller le bec sur le plus à droite 2 L cylindre. </li><li> Placer une petite barre d&#39;agitation dans la chambre cellule de chargement (figure 1A) et une plus grande barre d&#39;agitation dans le cylindre 2 L plus à gauche (figure 1B) qui contiendra le 2% de BSA. </li><li> Placer la chambre de sédimentation de 2 L sur la plate-forme (figure 1D). Placer la chicane métallique (figure 1F) directement au-dessus de l&#39;ouverture dans le fond de la chambre de sédimentation (Figure 1D). Ceci est important, car la chicane empêche tourbillonnement du liquide et de la perturbation du gradient de la cellule au cours de la collecte de fraction. Placer le couvercle sur le dessus de la chambre de sédimentation. </li><li> Après l&#39;application d&#39;une très petite quantité de graisse à vide pour le joint en verre rodé du robinet à trois voies (Figure 1G), serrer le robinet d&#39;arrêt à la partie inférieure de la sechambre de dimentation, reliant les joints en verre rodé du robinet d&#39;arrêt et la chambre de sédimentation. </li><li> Relier la chambre de cellule de chargement (Figure 1A) vers la droite la sortie du robinet d&#39;arrêt avec tubulure. Fermer le robinet. </li><li> Fixer le tube de fractionnement de cellule vers la sortie du robinet d&#39;arrêt gauche. Le tube de fractionnement comprend un morceau de tube avec une pipette Pasteur en verre reliée à l&#39;extrémité ouverte. Un petit morceau de tube de diamètre est fixée à l&#39;extrémité étroite de la pipette en verre. La pipette étroite limite l&#39;écoulement de la suspension de cellules pendant la fraction collecteur. Fixez ce petit tube au bas. </li><li> Préparer 2 L Krebs (1x) tamponner le jour de l&#39;expérience (tableau 1). Ensuite, préparer 550 ml de 2% de BSA dans du Krebs 1x, 550 ml de 4% de BSA dans du Krebs 1x, et 50 ml de 0,5% de BSA dans du Krebs 1x. Filtrer et refroidir ces solutions à 4 ° C. </li><li> Verser la solution de BSA à 4% dans le cylindre droit 2 L (figure 1C) et la BSA à 2%solution dans le cylindre de gauche 2 L (figure 1B). Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de grosses bulles dans le tube qui relie ces cylindres. </li><li> Verser tampon Krebs dans la chambre cellule de chargement et de remplir le tube reliant cette chambre avec la chambre de sédimentation, en veillant qu&#39;il n&#39;y a pas de grosses bulles, car ils pourraient perturber le gradient. Presser ou effleurant le tube aide doucement pour enlever les bulles. Assurez-vous que tout le tampon de Krebs est dans le tube et pas dans la chambre de cellule. </li><li> Laissez une petite quantité de tampon Krebs de s&#39;écouler dans la chambre de sédimentation et puis égouttez presque tout le tampon dans le tube de fractionnement cellulaire afin de remplir le tube et enlever les grosses bulles. </li><li> Placer le collecteur de fractions, directement sous la chambre de sédimentation. Assurez-vous que tous les tubes de fractions sont en place et recouverts d&#39;une pellicule de plastique pour éviter la contamination. </li></ol> 2. Isoler les cellules de la spermatogenèse de testicules entiers <ol&gt; <li> Disséquer les testicules de ca 12 souris adultes (de préférence au moins huit semaines) et les placer dans un tampon de Krebs à la température ambiante pour laver toute matière contaminante. Ce protocole est démontré implique l&#39;utilisation de la souris de laboratoire et a été exécuté en conformité avec les lignes directrices de l&#39;Université de Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux en Pennsylvanie. </li><li> Ajouter 45 mg de collagénase à 50 ml de tampon Krebs dans un tube conique juste avant vous avez l&#39;intention d&#39;ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques. </li><li> Décapsuler les testicules dans une plaque séparée contenant 8 ml de tampon Krebs, en rejetant la tunique albuginée et libérer les tubules séminifères. La tunique albuginée est la fine membrane qui entoure les tubes séminifères. Les tubes devraient facilement se détacher de l&#39;albuginée. Pour ce faire, faire une incision dans la tunique albuginée, maintenez cette membrane avec une pair des forceps, et pousser les tubes et hors de l&#39;écart de la membrane avec une autre paire de forceps. </li><li> Ajouter 4 ml de tampon de Krebs contenant les tubules à chaque tube conique contenant 25 ml de solution de collagénase et incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min. A la fin, les tubules devraient avoir une apparence «spaghetti-comme&quot;. </li><li> Laisser les tubules se déposer pendant environ 5 min à la partie inférieure du tube. Verser le surnageant et laver 2x dans 25 ml de tampon Krebs (à température ambiante), ce qui permet les tubules de se déposer au fond du tube à chaque fois. Ajouter 5 ml de tampon Krebs ~ dans chaque tube. </li><li> Bien laver, ajouter 30 mg de trypsine à 50 ml de tampon Krebs dans un tube falcon juste avant vous avez l&#39;intention d&#39;ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques. </li><li> Ajouter 25 ml de solution de trypsine à chacun des deux tubes contenant les tubules. Ajouter 3 pg DNAse (1 μg/10ml) à chaque tube pour éviter cellules à partir de l&#39;agglutination. Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min. </li><li> Utiliser une pipette de grand calibre pour agiter la solution contenant les tubes, les pipetage dans et hors d&#39;environ 10x. La solution devrait commencer à ressembler davantage à une suspension cellulaire unique. </li><li> Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant encore 10 min. Utiliser une pipette de grand calibre pour disperser les tubules dans une suspension de cellules individuelles, les pipetage dans et hors d&#39;environ 25x. Si vous voyez encore beaucoup de tubes ou amas de cellules, disperser plus avec la pipette et / ou ajouter un autre 3 pg DNAse à chaque tube (concentration initiale double). </li><li> On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille 100 um (un pour chaque tube de 30 ml de suspension cellulaire). Combiner les suspensions cellulaires et de compter le nombre total de cellules (qui devrait être entre 7-8 x 10 8 cellules). *** NE PAS charger plus de 800 000 000 cellules sur le gradient. </li><li> Sur la base du nombre de cellules obtenu à l&#39;étape 2.10, le culot approprle volume iate de cellules filtrées à 450 rcf pendant 5 minutes et laver avec 30 ml de tampon Krebs. Répétez. Habituellement *** 22 testicules vont produire plus de 800 000 000 cellules, mais ne chargez pas plus de ce nombre de cellules. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec précaution dans 25 ml de 0,5% de BSA contenant entre 2,5 et 5 pg de DNAse (en fonction du degré d&#39;agglutination cellulaire) sans créer de bulles. Assurez-vous que les cellules ne se collent pas. On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille de 100 um. Les cellules sont maintenant prêts à charger. Mélangez bien avant le chargement en inversant le tube plusieurs fois. </li></ol> 3. Cellule de chargement et de sédimentation <ol><li> Assurez-vous que le robinet d&#39;arrêt est fermée, mais dans la position qui permet au liquide de s&#39;écouler de la chambre de cellule (figure 1A) dans la chambre de sédimentation (Figure 1D). </li><li> Tournez les deux plaques de barres d&#39;agitation sur un réglage bas (environ 70 min) pour permettre aux barres d&#39;agitation pour se déplacer en permanence, mais lentement. </li><li> Verser la suspension de cellules dans la chambre de cellule (figure 1A) et d&#39;ouvrir le robinet d&#39;arrêt de telle sorte que les cellules s&#39;écoulent lentement dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min (figure 1D). Fermer le robinet. Le débit peut être déterminé par le marquage des intervalles de volume de la chambre de sédimentation. </li><li> Verser 5 ml de solution de BSA à 0,5% dans la chambre de cellule et de s&#39;écouler dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min. Fermer le robinet. Cette étape de lavage des cellules en dehors de la chambre de cellule. Répétez 4x. </li><li> Préparer le gradient: ouvrir les pinces entre la chambre à cellules (Figure 1A) et les deux cylindres 2 L (Figure 1B et C), et de commencer à vider le liquide dans la chambre de décantation à un débit de 40 ml / min (figure 1D) immédiatement. Ajuster le débit d&#39;écoulement de sorte qu&#39;il faut environ 20 à 30 min pour charger le gradient de BSA dans la chambre de sédimentation. Une mince couche de cellules intactes située au-dessus de laBSA gradient doit être visible. Une fois la plupart des BSA est chargé, fermer le robinet et le tourner à la position qui permettra liquide s&#39;écouler de la chambre de sédimentation dans le tube de fractionnement. </li><li> Eteignez les plaques d&#39;agitation. </li><li> Laisser les cellules sédimenter pendant une heure et 45 minutes. NE TOUCHEZ PAS L&#39;APPAREIL PENDANT CE TEMPS. Toute agitation mécanique pourrait perturber le gradient. </li></ol> 4. Le fractionnement et l&#39;analyse des fractions *** Lorsque vous effectuez les étapes suivantes, veillez à ne pas perturber le gradient. Si le gradient BSA est perturbé, la procédure ne fonctionnera pas! <ol><li> Une fois que les cellules ont sédimenté, vider lentement 50 ml de la chambre de sédimentation dans un tube conique de 50 ml et mettre de côté. Cette fraction contient généralement des amas de cellules non désirées et les débris. </li><li> Fixez le tube de fraction vers le collecteur de fraction. *** Il est également possible de recueillir les fractions à la main si une fraction de collecteur n&#39;est pas disponible. </li><li> Recueillir des fractions: Régler le débit avec le robinet de sorte que 10 ml (remplissage d&#39;un tube de collecte) sont recueillies toutes les 45 sec. </li><li> Boucher les tubes de collecte de fraction et tourner pendant 5 min à 450 rcf à 4 ° C. Verser doucement le surnageant, remettre les cellules en liquide restant, et garder les cellules sur la glace. </li><li> Une fois toutes les fractions sont recueillies, analyser au microscope les fractions de différentes populations cellulaires. Différents types de cellules peuvent être distingués en fonction de la taille des cellules et la morphologie nucléaire 8,15. Figure 2 illustre &quot;des résultats représentatifs&quot; pour les trois fractions rassemblées qui sont enrichies en cellules et les spermatogonies (a) somatiques et méiotiques, (b) spermatides rondes, et (c) allongement et condensation spermatides. <ul><li> Tapez spermatogonies sont 12 14μm environ. de diamètre et ont des noyaux ronds qui sont homogènes en composition de la chromatine. </li><li> Spermatogonies de type B sont 8-9μm ca. de diamètre et ont rounnoyaux d qui montrent hétérochromatine plus dense le long de la périphérie du noyau. </li><li> Spermatocytes pré-leptotène sont 7,5 8.2μm ca. de diamètre, ont moins de cytoplasme de spermatogonies de type B, et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de type B spermatogonies. </li><li> Spermatocytes primaires sont leptotène 8-10 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes pré-leptotène, mais semblent gagner la chromatine plus dense à la membrane nucléaire. </li><li> Zygotene spermatocytes primaires sont 10-12 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes primaires leptotène. </li><li> spermatocytes Pachytène sont partout de 12 à 18 um ca. de diamètre et sont constituées d&#39;un mince rebord du cytoplasme entourant un gros noyau. Plus amas de chromatine dense peuvent être vus dans le noyau. </li><li> spermatides rondes sont de 10 um ca. de diamètre et ont un noyau rond avec une forte densité de coloration chromocentre au milieu. </li><li> Résiduelcorps sont ~ 6,5 m de diamètre, sont ronds, et n&#39;ont pas de noyau. </li><li> D&#39;allongement et condensation spermatides sont de taille similaire à arrondir spermatides, mais avoir un noyau unique, en forme de faucille. </li></ul><ol><li> Commencez par fraction de 15 et d&#39;analyser tous les cinq fractions jusqu&#39;à 85. Habituellement, les fractions inférieures à 15 seront trop mixte et touffue, et les fractions supérieures à 85 contiennent peu ou pas de cellules utilisables. </li><li> Pour analyser une fraction, prendre 5uL de liquide depuis le tube de collecte de fractions (une fois que les cellules ont été remises en suspension après centrifugation) et ajouter à 5uL de 8% de formaldehyde dans du tampon Krebs. Laisser les cellules fixées au repos à température ambiante pendant cinq minutes. </li><li> Ajouter 5uL de 0,1% de Triton et DAPI (5 de tampon μ / ml de Krebs) pour les cellules fixes. Laisser les cellules au repos à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Placer 10 ul de la solution obtenue sur une lame, couvrir avec une lamelle, et d&#39;analyser avec un microscope à fluorescence pour déterminer la pureté de chaque fraction. </li><li> Combiner les fractions qui sont similaires en taille et la morphologie nucléaire (voir «Les résultats représentatifs») pour créer les populations suivantes de cellules: les cellules diploïdes de la méiose et somatiques, spermatides rondes et condensation / montaison spermatides. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents. Ce protocole est démontré implique l&#39;utilisation de la souris de laboratoire et a été exécuté en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Animaux utilisés dans ce protocole sont maintenues sous la direction et l&#39;approbation de l&#39;Université de comité de protection et d&#39;utilisation des animaux Pennsylvanie (IACUC protocole # 804284).

Ceux qui étudient la spermatogenèse s&#39;appuient sur ​​des modèles animaux pour des échantillons de cellules spermatiques, comme il n&#39;existe pas encore un système de culture cellulaire fiable pour générer tous les types cellulaires de la spermatogenèse 3. Bien que les cellules spermatiques sont facilement collectées à partir des testicules entiers, seule une population mixte résulte. Cela pose un problème pour ceux qui souhaitent étudier les sous-types spécifiques de ces cellules, comm...

Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules 1. En bref, la tige-comme spermatogonies qui résident près de l&#39;épithélium du tubule séminifère fracture et se différencient en spermatocytes, qui subissent alors des divisions méiotiques. Après la méiose est terminée, les cellules haploïdes résultant, ou spermatides rondes, subissent la spermiogenèse, un processus de différenciation qui implique l&#39;effusion du cytoplasme et le compactage du noyau. Spermatides développent progressivement un flagelle et subissent un allongement et la condensation du noyau, la production d&#39;allongement puis condensation spermatides, respectivement. Les produits finaux sont les spermatozoïdes, qui sont libérés dans la lumière du tube séminifère et finalement dans l&#39;épididyme, où ils mûrissent plus loin. Parce que le processus de la spermatogenèse dépend des conditions hormonaux et moléculaires spéciauxles testicules, un système fiable de culture in vitro pour l&#39;ensemble du processus de la spermatogenèse n&#39;a pas encore été mis au point 2,3. Les méthodes de culture ont été développés pour créer des &quot;cellules analogues à des cellules germinales primordiales» et «cellules rondes de spermatides comme&quot; haploïdes à partir de cellules souches, mais ces méthodes ne sont pas encore en mesure de générer un grand nombre de ces cellules et ne parviennent pas à produire cellule spermatogenèse plus tard types de 4,5. Heureusement, les types de cellules spermatiques diffèrent de manière significative dans la taille, ce qui permet une suspension à cellule unique obtenue à partir de testicules entiers à séparer avec un gradient liquide. La méthode STA-PUT, démontré ici, utilise un gradient linéaire BSA et simple sédimentation pour séparer les cellules spermatiques fonction de la taille et de la masse 6-9. La méthode STA-PUT a plusieurs avantages par rapport aux deux autres méthodes les plus utilisées pour séparer les types de cellules spermatiques: FACS et élutriation 10-13. L&#39;appareil STA-PUT nécessite ONLy plusieurs pièces de verrerie spécialisé assemblés dans une chambre froide ou un grand réfrigérateur. Ainsi, il est moins coûteux que d&#39;utiliser un trieur de cellules ou un séparateur par décantation. La méthode STA-PUT produit des quantités plus élevées de cellules par type de cellule et les testicules que peuvent être triés par FACS dans un laps de temps comparable, bien que la pureté de chaque population de cellules n&#39;est pas aussi élevés que ceux obtenus avec FACS 11. Tri cellulaire utilisant des billes magnétiques (magnétique tri cellulaire activé, MACS) a récemment été utilisée avec succès pour l&#39;enrichissement de spermatogonies à partir d&#39;une population de cellules testiculaires mixte, mais il est actuellement inadapté pour séparer spermatocytes ou spermatides en raison du manque de connaissances de surface appropriée les marqueurs 14. Un avantage supplémentaire de la méthode STA-PUT sur FACS ou MACS est la capacité à isoler des cellules viables aptes à la culture ultérieure parce que, contrairement à la plupart des protocoles de FACS, il ne nécessite pas d&#39;ADN ou d&#39;autres types de coloration. Pour des études nécessitant lrendements arge de la spermatogenèse types de cellules à ~ 90% de pureté, le STA-PUT est une méthode idéale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules. Actuellement, il n&#39;existe pas de système de culture cellulaire fiable permettant la différenciation de la spermatogenèse in vitro, et la plupart des études biologiques des cellules spermatiques nécessite récolte des tissus de modèles animaux comme la souris et le rat. Parce que le testicule contient de nombreux types cellulaires - à la fois non-spermatogenèse (Leydig, de Sertoli, myéloïdes et les cellules épithéliales) et la spermatogenèse (spermatogonies, spermatocytes, spermatides rondes, condensation spermatides et spermatozoïdes) - études des mécanismes biologiques impliqués dans la spermatogenèse nécessiter l&#39;isolement et l&#39;enrichissement de ces différents types cellulaires. Procédé STA-PUT permet la séparation d&#39;une population hétérogène de cellules - dans ce cas, des testicules - à travers un gradient linéaire de BSA. Types cellulaires individuels sédimentent avec la vitesse de sédimentation différente selon CEtaille de ll, et les fractions enrichies en différents types de cellules peuvent être recueillies et utilisées dans d&#39;autres analyses. Bien que la méthode STA-PUT n&#39;entraîne pas de fractions très pures de types de cellules, par exemple comme on peut obtenir avec certaines méthodes de tri cellulaire, il ne fournit avec un rendement beaucoup plus élevé de cellules totales dans chaque fraction (~ 1 x 10 8 cellules / spermatogenèse type à partir d&#39;une population de départ de 08.07 x 10 8 cellules de la cellule). Cette méthode à haut rendement nécessite que la verrerie spécialisée et peut être effectuée dans n&#39;importe quelle pièce froide ou grand réfrigérateur, ce qui en fait une méthode idéale pour les laboratoires qui ont un accès limité à de l&#39;équipement spécialisé comme un trieur activé par fluorescence de cellules (FACS) ou élutriateur.

Le résultat idéal de la procédure STA-PUT est une séparation assez notable des cellules des testicules sur la base de la taille des cellules et de la densité. Alors que les cellules isolées à partir des testicules sont sédimentation à travers le gradient de BSA, plusieurs bandes distinctes de cellules peuvent être observées. Toutes les amas de cellules ont tendance à couler au fond de la pente et ne pas contaminer les autres fractions. Un peu plus haut sur la pente sera le grand cellules somatiques et méiot...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation at JoVE.com

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Procédé STA-PUT permet la séparation des différentes populations de cellules spermatiques fonction de la taille et de la densité.

Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

JoVE Journal

Biology

25.5K vues.  University of Pennsylvania.  Procédé STA-PUT permet la séparation des différentes populations de cellules spermatiques fonction de la taille et de la densité. 

Vidéo: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Recherche

Biologie

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Séparation électrophorétique de protéines

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

L&#39;accouplement et la séparation des Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Pour l&#39;analyse génétique

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Électrophorèse sur gel d&#39;agarose pour la séparation de fragments d&#39;ADN

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel bayésienne changement de point Algorithme pour l&#39;échelle du génome Analyse des données ChIPseq divers types de

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Séparation de souris embryonnaires ectoderme visage et Mesenchyme

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Comparaison de tabac Méthodes hôte cellulaire Protein suppression par Blanchir plantes intactes ou par traitement thermique des extraits

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...