Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Philina S. Lee et Alan D. Grossman pour un premier entraînement LAS en microscopie à fluorescence. Les auteurs remercient également les Drs. Mélanie Berkmen et Hajime Kobayashi de l&#39;aide et des conseils pour l&#39;imagerie. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du Collège de Littérature, Sciences &amp; Arts et du ministère de la biologie moléculaire, cellulaire et du développement à l&#39;Université du Michigan.

Cultures en croissance de cellules pour la microscopie 1. Un ou deux jours avant l&#39;imagerie, de préparer le B. subtilis souche contenant la protéine de fusion traductionnelle vous souhaitez visualiser. Tours de première instance de 1A et 1B étapes seront nécessaires pour déterminer quelle condition la croissance fournit les meilleures images de vos contraintes. Dans la plupart des cas, les cellules doivent être imagés pendant la phase de croissance exponentielle. <ol class="ualpha"><li> Pour certaines B. souches subtilis (en particulier, les souches qui poussent mal en raison de l&#39;intégration de la fusion traductionnelle entre le gène d&#39;intérêt et de la GFP à son locus endogène), la croissance initiale de deux jours avant l&#39;imagerie est nécessaire pour des images de haute qualité. Le premier jour, série B. subtilis souche à imager sur gélose LB avec antibiotique sélectif (s) et incuber une nuit à 30 ° C. Le deuxième jour, inoculer 100 pl de solution saline à 0,85% avec une seule colonie et de réaliser trois de 10 dilutions successives sur les plaques d&#39;agar LB (avec des antibiotiques sélectifs), le placage 100 ul de chaque dilution, suivie par une nuit d&#39;incubation à 30 ° C. Le troisième jour, sélectionnez la plaque de dilution avec une croissance confluente lumière des cellules. Lumière croissance confluente sur une plaque fournira le milieu de croissance avec une bonne santé, l&#39;inoculum de départ en croissance exponentielle pour éventuellement donner des résultats excellents imagerie (voir étape 4). Cette étape est particulièrement utile pour l&#39;imagerie de membrane de haute qualité avec la tache FM4-64. </li><li> B. Autres souches subtilis peut simplement être appliquée à un milieu LB gélose sélective pour les colonies isolées avec un bâton stériles le jour précédant l&#39;imagerie et incuber une nuit à 30 ° C. Le jour suivant, les cellules sur cette plaque sera suffisant pour utiliser comme inoculum pour l&#39;imagerie (voir étape 4). REMARQUE: Pour B. subtilis, cultures de la nuit dans un milieu liquide ne sont pas appropriées en raison d&#39;une combinaison de la formation de spores et les réponses de quorum, ce qui provoquera une longue période de croissance une phase de latence. </li></ol> 2. Le matin de l&#39;imagerie, placer 10 ml de S7 50 moyennes 1-3 dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml stérile. 3. Resuspendre les cellules dans un maximum de 2 mL de S7 50 moyennes de la plaque de gélose LB avec des colonies isolées ou les cellules confluentes de lumière pour obtenir un inoculum. 4. Ajouter suffisamment S7 50 moyen de cellules d&#39;inoculum à l&#39;erlenmeyer contenant 10 ml S7 50 moyennes pour une culture avec une densité optique initiale mesurée à 600 nm (DO 600) de ~ 0,08 à 0,1. À cette étape, il est important d&#39;avoir au moins un air de 10 fois le ratio moyen. Ainsi, nous utilisons 10 à 12,5 ml de milieu inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml. 5. Croître chaque culture à 30 ° C jusqu&#39;à ce que la culture atteint une DO 600 ~ de 0,5 à 0,8. Bains à agitation sont préférés aux révolutions par minute à partir 150-200. Cultures a contesté avec des agents endommageant l&#39;ADN induisant ou de l&#39;asymétrie doit être à une phase de croissance exponentielle au début OD 600 de telle sorte que les cellules vont atteindre l&#39;objectif OD 600 avec la période de croissance supplémentaire qui est requis pour le traitement (voir tableau 1) Par exemple, la 2-aminopurine nécessite une heure de traitement, et donc une culture traitée avec la 2-aminopurine devrait être à une DO 600 ~ 0.3 à 0.4, telles que l&#39;heure l&#39;un des traitements / résultats de croissance dans une DO 600 ~ 0.5-0.8, par lequel les cellules sont prêtes pour l&#39;imagerie. Préparation des échantillons 1. Pipeter 300 ul de cellules cultivées dans un tube de 1,5 ml. 2. Si l&#39;imagerie des membranes cellulaires est souhaitée, ajoutez la dilution de 1:1000 FM4-64 membrane tache (Invitrogen) pour chaque échantillon d&#39;une solution à 1 mg / ml. Un titrage de FM4-64 peut être nécessaire pour atteindre le signal de fluorescence désirée. Une gamme de titrage typique est 1:100, 1:1000 et 1:10000. 3. Laisser les échantillons reposer à température ambiante pendant jusqu&#39;à dix minutes ou alors la lame est en préparation avec 1% d&#39;agarose en 1X moyennes Spizizens comme décrit ci-dessous (voir l&#39;étape 1 de &quot;préparation des lames»). 4. Si la concentration de cellules est nécessaire, nous préférons les cellules de filtrage utilisant un filtre de 0,2 um avec un appareil à vide. Les cellules peuvent ensuite être lavés en douceur de la surface du filtre avec du PBS, un autre tampon approprié ou moyenne avant la visualisation. Préparation des lames 1. Préparer agarose à 1% avec 1X Spizizens. Ajouter 5 ml de bouillon de Spizizens 10X à 45 ml ddH2O avec 0,5 g d&#39;agarose, et micro-ondes pour faire fondre. Chaud agarose fondu est difficile de pipette, et solidifié agarose n&#39;entrera pas dans la pointe de la pipette. L&#39;agarose doit être équilibrée dans un bain d&#39;eau à une température de 55-65 ° C ~ pour elle d&#39;entrer dans la pointe de la pipette sans se solidifier dans le<html> pointe. 2. Tirage 20 ul de Spizizens avec 1% d&#39;agarose fondu dans la pointe de la pipette. Pipeter une seule goutte (environ 1-2 pi) de la solution d&#39;agarose dans chaque diapositive ainsi (nous utilisons 15 et diapositives, voir tableau 2) pour former superficielle coussinets d&#39;agarose. L&#39;agarose se solidifie immédiatement. Les diapositives doivent également être faite immédiatement avant l&#39;application de ces cellules. Si les plaquettes sont agarose laissé à température ambiante seuls, ils peuvent se déshydrater en quelques minutes et devenir inutilisable. Coussinets agarose doit être centré et remplir chaque bien, mais avoir une hauteur minimale pour éviter de perturber la lamelle, si les gouttelettes sont trop élevés (en bulle) ou si l&#39;échantillon se propage au-delà des limites bien, passez simplement le bien nettoyer avec un Kimwipe et appliquer une nouvelle agarose pad. 3. Appliquer l&#39;ensemble échantillon de 300 ul (voir étape 6) à la diapositive, distribué sur le dessus de chaque pad agarose. Cette quantité de cellules devrait être suffisante pour couvrir chaque puits sur la diapositive. 4. Laisser la lame avec des cellules chargées de s&#39;asseoir à la température ambiante (23 ° C) pendant environ dix minutes. Cette étape va permettre aux cellules de s&#39;installer sur le coussin d&#39;agarose devenir immobiles et prêts pour l&#39;imagerie. Pour des besoins spécialisés de cette température peut être nécessaire de changer, par exemple, lors de la réalisation des expériences qui nécessitent un changement de température 4. 5. Aspirer l&#39;écart moyen supérieur de chaque puits sans enlever les plaquettes elles-mêmes. 6. Appliquer la lamelle sur la lame, en appuyant fermement et uniformément, mais doucement, à travers la zone de la diapositive. Assurez-vous que la lamelle est contre la lame et que la lamelle n&#39;est pas élevée au-dessus de la diapositive. Visualisation des cellules 1. Beaucoup de différents microscopes à fluorescence va bien travailler. Il est essentiel d&#39;avoir une lentille d&#39;huile d&#39;immersion 100X. Le laboratoire utilise Simmons: <ul><li> Olympus BX61 microscope équipé d&#39;1,45 NA TIRFM huile lentille 100X objectif à immersion </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD refroidi appareil </li><li> Lumen métallique à l&#39;arc 200 (Avant) source de lumière. </li><li> Pour la détection de la GFP (ITCF), filtre d&#39;excitation et d&#39;émission de 460 à 500 510 à 560 </li><li> Pour la détection de FM4-64 (TRITC), filtre d&#39;excitation et d&#39;émission de 510 à 560 572 à 648. </li><li> Les images ont été capturées à l&#39;aide SlideBook 4,2 (figure 1) </li></ul> 2. Apportez les cellules en utilisant concentrer la lumière blanche. 3. Capturer l&#39;image en utilisant des filtres appropriés pour chaque fluorophore. Les résultats représentatifs Des images représentatives sont affichés (figure 1). GFP foyers doivent être bien définis, tandis que FM4-64 coloration doit être claire et lumineuse 4-7. Images GFP ou membrane peut être pseudo-couleur avec n&#39;importe quelle couleur, afin de permettre la meilleure qualité d&#39;image qui sera présentée sans perdre aucune donnée. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: les images représentant la GFP de B. subtilis protéines de fusion traductionnelle. protéines GFP sont indiquées en vert, tandis coloration FM4-64 membrane est représentée en rouge. La barre d&#39;échelle blanche indique 3 microns (A) MutS-GFP [génotype pertinents: mutS - gfp (CPS), Amye:: CCPFP mutL (chat)]. En présence de 600 ug / ml 2-aminopurine et 1 mM d&#39;IPTG. FM4-64 du signal n&#39;est pas présentée de manière à montrer plus clairement les foyers MutS-GFP (B) MutL-GFP [génotype pertinents: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. En présence du 2-aminopurine (C) DNAX-GFP [génotype pertinents: DNAX:: DNAX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [génotype pertinents: recA:: recA-GFP (SPC)] en présence de 20 ng / ml de mitomycine C (E) tagC-GFP [génotype pertinents: tagC:: tagC-GFP (CPS) ] en présence de 1 pg / ml de mitomycine C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Traitement / concentration ou la quantité </td><td> Fonction </td><td> Temps d&#39;incubation </td></tr><tr><td> La mitomycine C (MMC) [20 à 150 ng / ml] </td><td> Agent alkylant l&#39;ADN </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 ug / ml] </td><td> induisant discordance </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyurée (HU) </td><td> épuise les dNTP </td><td> 3 heures </td></tr><tr><td> la lumière ultraviolette (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymine-thymine dimères et 6-4 photoproduits </td><td> varie selon la source, habituellement 20 secondes </td></tr><tr><td> grays (rayonnements ionisants) 5 à 100 Gy </td><td> Cassures double brin, cassures simple brin et les sites de dégâts de base </td><td> varie selon la source </td></tr></tbody></table>»&gt; Tableau 1. Résumé des endommageant l&#39;ADN et des traitements induisant discordance <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Multitest diapositives, 15 puits </td><td> MP Biomédical </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Verre Couverture Microscope </td><td> Fisher </td><td> 12 à 544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fisher </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycine C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagène, porter des gants </td></tr><tr><td> 2-aminopurine </td><td> Sigma </td><td> A3509-250MG </td><td> des gants </td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyurée </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> des gants </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> sensible à la lumière </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Liste des réactifs et équipements spécifiques:

<ol>
	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

Essais et erreurs sont nécessaires pour trouver des conditions d&#39;exposition pour des images de haute qualité pour chaque souche; nous trouvons que 1 milliseconde est approprié pour des images en lumière blanche, tandis que des expositions de 100 à 2000 ms sont appropriés pour la GFP (FITC) et FM4-64 (TRITC ) des images. Le temps d&#39;exposition varie en fonction de l&#39;équipement d&#39;imagerie utilisée. Nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;une souche par lame de microscope 15 puits pour les plus sim...

Recettes solution spécifique 1: S7 10x 50 sels de 0,5 M MOPS 100 mM de sulfate d&#39;ammonium 50 mM phosphate de potassium monobasique Stériliser par filtration, et enveloppez-S7 50 médias dans la feuille avant l&#39;entreposage Métaux 100x 0,2 M MgCl 2 70 mM de CaCl2 5 mM de MnCl2 0,1 mM ZnCl2 100 pg / ml de thiamine HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O au volume final * FeCl 3 devrait être ajouté en dernier, pour empêcher la précipitation. Après la stérilisation du filtre, la solution de métal envelopper dans du papier 100x. S7 50 médias 1x S7 50 sels de Métal 1x 1% de glucose Glutamate 0,1% 40 ug / ml tryptophane 40 ug / ml phénylalanine H 2 O distillée au volume final Spizizens 10x (grammes / L) 151,4 mM de sulfate d&#39;ammonium (20g / L) 803,8 mM Potassium phosphate monobasique (140g / L) 440,9 mM de potassium phosphate dibasique (60g / L) 34,0 mM citrate de sodium (10g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / L) dH 2 O au volume final Stériliser par filtration

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

Les deux procaryotes et les eucaryotes répondent aux dommages à l&#39;ADN à travers un ensemble complexe de changements physiologiques. Altérations de l&#39;expression génique, la redistribution des protéines existantes, et l&#39;assemblage des complexes protéiques nouvelle peut être stimulée par une variété de lésions de l&#39;ADN et dépareillés paires de bases d&#39;ADN. La microscopie à fluorescence a été utilisé comme un puissant outil expérimental pour la visualisation et la quantification de ces réponses et autres lésions de l&#39;ADN et à surveiller l&#39;état de réplication de l&#39;ADN au sein de l&#39;architecture complexe subcellulaire d&#39;une cellule vivante. Fusions traductionnelles entre les protéines rapporteur fluorescent et des composants de la réplication de l&#39;ADN et les machines de réparation ont été utilisés pour déterminer les indices que les protéines cibles réparation de l&#39;ADN de leurs lésions apparentées<em&gt; In vivo</em&gt; Et de comprendre comment ces protéines sont organisées dans les cellules bactériennes. En outre, les fusions transcriptionnelles et translationnelle liée à des promoteurs inductibles endommager l&#39;ADN ont révélé que les cellules au sein d&#39;une population ont activé les réponses au stress génotoxique. Dans cette revue, nous proposons un protocole détaillé pour l&#39;utilisation de la microscopie par fluorescence à l&#39;image de l&#39;assemblage de réparation de l&#39;ADN et des complexes de réplication de l&#39;ADN dans des cellules bactériennes simples. En particulier, ce travail se concentre sur les protéines de réparation des mésappariements d&#39;imagerie, la recombinaison homologue, la réplication de l&#39;ADN et une protéine de SOS-inductible dans<emBacillus subtilis&gt;</em&gt;. Toutes les procédures décrites ici sont facilement prête pour les complexes protéiques d&#39;imagerie dans une variété d&#39;espèces de bactéries.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis at JoVE.com

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Un protocole détaillé est décrit pour l&#39;imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de l&#39;ADN<emBacillus subtilis&gt;</em&gt; Cellules.

Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l&#39;ADN dans<emBacillus subtilis></em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

10.9K vues.  University of Michigan-Ann Arbor. Un protocole détaillé est décrit pour l'imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de l'ADN Cellules.

Vidéo: Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Recherche

Biologie

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l&#39;ADN

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d&#39; ADN et l&#39; ADN oxydative dommages de foie de rat

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Enquête sur les néfastes effets de basse pression Plasma stérilisation sur la survie de Bacillus subtilis Spores en utilisant Live microscopie des cellules

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Analyse de Microfluidic unicellulaire de Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...