Nous remercions nos collaborateurs pour fournir des échantillons de protéines précieuses, qui ont contribué à certaines de nos méthodes relatives expérience et les observations. Günther Schmalzing aimablement fourni l&#39;occasion de FR à rejoindre ce projet. Barbara Armbruster, Jacob Brink et Mills Deryck sont remerciés pour leur aide exceptionnelle et d&#39;entrée sur l&#39;équipement. Le financement a été fourni par NIH HL090630.

1. Préparation Grille des essais de cristallisation 2D <ol><li> Revêtues de carbone de 400 mailles de cuivre EM grilles sont préparés par coloration négative. L&#39;acétate d&#39;uranyle est fréquemment utilisé et fournit une tache de longue durée en termes de stockage de la solution pendant plusieurs mois avant de les utiliser, ainsi que l&#39;aptitude à l&#39;entreposage à long terme des réseaux. En revanche, d&#39;autres taches négatifs tels que le formiate d&#39;uranyle, tout en offrant une excellente coloration, doivent être fraîchement préparé 1. Pour la préparation rapide d&#39;un grand nombre de réseaux qui seront utilisés pour le dépistage des essais de cristallisation 2D, une version modifiée de coloration négative est utilisée. Un volume de 2 pl de l&#39;échantillon est pipeté sur une grille recouverte de carbone-EM et incubées pendant 60 s. Elle est suivie par buvard à partir du bord avec un morceau déchiré de papier Whatman n ° 4 filtre (Figure 1; vidéo), puis 2 ul d&#39;acétate d&#39;uranyle 1% sont appliquées immédiatement, qui sont de nouveau effacés à partir du bord de la grille après le 30 s. Touchant la grille sur la jante avecle bord déchiré du papier filtre assure une élimination optimale de liquide sans enlèvement de protéoliposomes. En outre, le séchage sur le bord de la grille permet une meilleure conservation de la couche de carbone. Des précautions doivent être prises dans la préparation et la manipulation des grilles, comme la rupture de la couche de carbone délicate empêche l&#39;adhérence de l&#39;échantillon et peut se traduire par une représentation inexacte de l&#39;échantillon. Bien que les volumes d&#39;échantillon traditionnellement une version agrandie de 5 ul ont été et sont couramment utilisées pour la préparation de la grille, précieux échantillons peuvent être sauvegardées en réduisant le volume à 2 pi ou moins 2. </li><li> Pour produire les plus grands possibles membranes, certains de nos échantillons nécessitent de fortes concentrations de glycérol ou le saccharose (10-20%) d&#39;être présent dans le tampon de dialyse. Cela peut avoir un effet négatif sur la préparation grille, comme le glycérol ou le saccharose est très visqueux et empêche l&#39;acétate d&#39;uranyle de bien pénétrer dans la mémoire tampon, et donc incomplète coloration des membranes. Par conséquent, un treillis sera possible obsguérie. Supporte le tampon peut être remplacé par centrifugation des échantillons et le remplacement de glycérol / sucrose sans tampon (non représenté), ou les grilles peuvent être lavés avec un tampon ou du glycérol / sucrose dans un tampon sans une à plusieurs cycles avant coloration négative semblables à une technique utilisée pour cryo-EM 3,4. </li></ol> 2. L&#39;évaluation des essais de cristallisation 2D par EM <ol><li> En fonction du type de support d&#39;échantillon, soit une ou plusieurs grilles sont chargés. Un grossissement de 2-10K, qui sera appelée ici grossissement intermédiaire, permet une première impression de la distribution moyenne et l&#39;étendue de la dispersion des membranes, la morphologie et la taille, ce qui est pris note de la notebook 5 laboratoire. Zones appropriées sont comptabilisés comme des aperçus représentatifs à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD ou, si une caméra CCD n&#39;est pas disponible, le film. </li><li> Faible grossissement dans la gamme d&#39;environ 400-800x est utilisé à des moments où un aperçu de l&#39;ensemble duéchantillon / grille est souhaitée. Même s&#39;il n&#39;est pas utilisé avec tous les réseaux, à faible grossissement donne des renseignements précieux d&#39;aide à l&#39;évaluation de la préparation du réseau en termes de plusieurs aspects: à la fois coloration négative et le potentiel de rupture partielle du film de carbone, concentration de l&#39;échantillon sur la grille, et peut-être inégale répartition protéoliposome. Cases de la grille individuelles peuvent être visualisés avec des jumelles ou une caméra CCD. Avec un peu d&#39;EM, il est possible d&#39;enregistrer les positions d&#39;un intérêt particulier, qui peuvent être rappelés pour une inspection subséquente à forts grossissements. </li><li> Une fois qu&#39;une zone de la grille d&#39;intérêt a été identifié à chaque grossissement faible ou intermédiaire, le grossissement est changé à environ 50K-60K. Selon la taille de la membrane cellulaire, le cristal et l&#39;unité, si elle est connue, grossissements aussi bas que 30K et 80K le plus haut sont utilisés. La plage de grossissement de 30-80K seront appelés à fort grossissement pour des fins de dépistage des cristaux 2D. Mise au point se fait soit dans la mise au point setttion de la faible dose set-up, avec interrupteur suite à image / photo de réglage, ou dans le voisinage de la zone d&#39;intérêt. <ol class="lalpha"><li> En cas d&#39;ambiguïté de savoir si la zone d&#39;intérêt est en effet une membrane, l&#39;échantillon est inspecté pour le carbone-film dans la taille des protéoliposomes, le mica, ou d&#39;autres objets. À cette fin, les bords révéler pliage et la morphologie. </li><li> Maintenant, la zone d&#39;intérêt est inspecté avec une caméra CCD. Une image CCD est recueilli à 30K-80K grossissement, selon la taille de la membrane, de protéines ou taille de cellule unitaire, ou connus zone cristalline. Le treillis d&#39;une protéine de la membrane plus petite et / ou en grande partie hydrophobe n&#39;est pas forcément visible par l&#39;évaluation visuelle de l&#39;image CCD lui-même. Soit la totalité de l&#39;image est utilisée pour une transformation de Fourier en ligne (FT, ou rapide FT-FFT). Cette FT contient une quantité importante de bruit, cependant, si le tableau commandé est faible. Ainsi, une taille de l&#39;image réduite en carton permettra un meilleur rapport signal-sur-bruit d&#39;un smaller cristal et une identification plus facile. A cet effet, la boîte est déplacée au-dessus de l&#39;image en temps réel et une FT est évaluée. L&#39;intensité / luminosité du faisceau est ajusté en gardant à faible dose conditions de l&#39;échantillon, ainsi que les réglages caméra CCD à l&#39;esprit. En fonction de la caméra CCD utilisée, le gamma de la FT est ajusté en temps réel pour l&#39;identification optimale des réseaux ordonnés. Une valeur trop élevée peut masquer les taches dues à des contributions de bruit, et une valeur de gamma trop faible empêche les plus faibles de points étant identifiés. Ces points faibles pourrait être due à de plus petits réseaux cristallins avec des taches dans le FT peine au-dessus du niveau de bruit. Bien que les données à plus haute résolution ont été recueillies sur un petit nombre d&#39;échantillons 6, communément la résolution de coloration négative cristaux 2D est limité ou ne devraient pas s&#39;attendre à être meilleure que la résolution 15 Å environ. Avec une défocalisation d&#39;environ -400 nm, pas plus de 1-3 ordres de taches devraient être easily identifié. Les échantillons sont généralement pas évalués pour la résolution, comme cryo-EM collecte de données donnera une bonne indication de la résolution la plus élevée possible. Netteté des taches et mosaïcité possible sont cependant de noter. </li></ol></li><li> Différentes membranes, ainsi que des morphologies membranaires, sont évalués à la commande à fort grossissement. Ceci est particulièrement important au début ou à des stades intermédiaires des essais de cristallisation 2D, comme protéoliposomes plus petits plutôt que de gros ou des correctifs membrane peut contenir des domaines les plus prometteurs. Un pourcentage très faible de cristaux 2D, il faudra acquisition de l&#39;image et du FT, ou de la diffraction optique, d&#39;un grand nombre d&#39;images depuis l&#39;identification initiale des tableaux commandés seront souvent mener à une amélioration rapide de la taille et de la qualité 2,4,7. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Protéoliposomes idéalement ordonnés afficher facilement identifiables, des points tranchants. Gros cristaux et ordonné unre facilement identifié par ligne-FT d&#39;images CCD ou de diffraction optique de microscope. L&#39;exemple montre des cristaux 2D d&#39;une petite protéine membranaire de 18kDa qui sont jusqu&#39;à plusieurs microns. Des taches sur le FT sont facilement identifiés et pointu. Le mouvement de la live box-FT montre que le réseau est continu, sans mosaïcité. Le treillis d&#39;une plus grosse protéine avec un domaine plus vaste soluble peut être identifié sur le petit écran des EM. Collection d&#39;images CCD et FT est nécessaire de prévoir un moyen de mieux évaluer et d&#39;obtenir des informations sur, par exemple, mosaïcité possible (Afficher FT). Lors du calcul d&#39;un FT d&#39;un protéoliposome qui n&#39;est pas imposée, le bruit peut d&#39;abord être confondu avec des taches. Alors que la boîte pour le live-FT est déplacé, cependant, les taches disparaissent. D&#39;autre part, les tableaux, avec de petites cristallinité discutable, auront leurs places restantes stationnaire quand la live-FT est déplacé voire légèrement au-dessus de la zone d&#39;image. En outre, thescristaux e petits peuvent être reconnus par ayant généralement les mêmes tailles de maille, et les distances entre les points dans les tables de tir différents peut être mesurée de différentes façons, comme avec un cercle d&#39;une taille spécifique. Cristaux de lipides présentent une morphologie distincte et treillis FT. Il n&#39;est pas rare de rencontrer des précipitations dans les essais initiaux. Voici la précipitation des protéines sans reconstitution doit être distinguée de petits agrégats lipidiques cependant. Les échantillons qui semblent être précipités à faible grossissement se révèlent souvent être des agrégats lipidiques lors du visionnage à plus fort grossissement. Lors de l&#39;inspection à 30-50K, les bords de ces structures sombres révèlent qu&#39;ils se compose de membranes sans précipitation de la protéine. Ces observations sont importantes car les agrégats lipidiques pourrait être augmenté en taille à de grandes membranes dans les expériences suivantes. Mauvais résultats dans l&#39;évaluation des échantillons sont parfois liés à une membrane de faible concenion qui empêche un dépistage adéquat et rapide. Cela peut souvent être surmontés par l&#39;utilisation d&#39;une concentration plus élevée en protéines de cristallisation 2D par dialyse. Alternativement, les membranes peuvent être laissés au repos pendant quelques jours au fond du tube Eppendorf pendant le stockage. Dans certains cas, décantation rapide, ou presque instantanée des membranes se produit et le pipetage du fond du tube se traduira par une forte densité de membrane sur la grille. Une autre solution est beaucoup plus rapide de centrifugation (à 3000-8000 rpm pendant minutes 1-3) d&#39;échantillons avec un échantillonnage subséquent de la partie inférieure du tube. Échantillons dans des conditions optimales contiendra un grand pourcentage de cristaux 2D. Il n&#39;est pas nécessaire de viser un aspect homogène des membranes, comme le plus grand et le mieux ordonné des cristaux 2D sont sélectionnées visuellement pour la collecte des données. Ces types d&#39;échantillons sera facilement reconnaissable lorsque les essais de cristallisation sont répétées ainsi que lorsque les échantillons sont utilisés pourcryo-EM collecte de données, résultant en un nombre maximum d&#39;images de haute résolution. <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cette figure montre buvard le bord de la grille avec un morceau déchiré de papier Whatman n ° 4 filtre.

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Évaluation appropriée des échantillons requiert un examen minutieux d&#39;un nombre suffisant de membranes. Par exemple, des échantillons avec aussi peu que 2% de réseaux cristallins sur plus de 180 protéoliposomes imagés ont donné des informations essentielles pour l&#39;optimisation rapide des conditions de cristallisation 2D 7. Lorsque la précipitation de la protéine se produit, une grille pourrait être abandonné d&#39;un dépistage supplémentaire après l&#39;insp...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> 400-maille des grilles de cuivre recouvertes de TEM film de carbone </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> pince: régulière et anti-capillaire </td><td></td><td></td><td></td><td> Dumont # 5 et Dumont N5AC ou similaire </td></tr><tr><td> Micropipette et pointes de pipette </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Whatman n ° 4 papier filtre </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> 1% d&#39;acétate d&#39;uranyle </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Dialyse samsonnes à subir un dépistage de cristaux 2D </td><td></td><td></td><td></td><td></td><tr><td> Glycérol / saccharose sans tampon de dialyse </td><td></td><td></td><td></td><td> En option </td></tr><tr><td> JEOL-1400 microscope électronique à transmission (MET) </td><td></td><td></td><td></td><td> semblable 80 - 120 kV TEM équipé d&#39;un filament de tungstène ou de LaB6 et le film et / ou des caméras CCD (Gatan Orius SC1000 et / ou UltraScan1000 caméras CCD et Gatan Digitial progiciel Micrograph ou caméras Tietz (TVIPS)) </td></tr></tbody></table></div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Cristallographie électronique a évolué comme une méthode qui peut être utilisée alternativement ou en combinaison avec trois dimensions cristallisation et cristallographie aux rayons X pour étudier la structure-fonction des questions de protéines membranaires, ainsi que des protéines solubles. Dépistage des cristaux bidimensionnels (2D) par microscopie électronique à transmission (EM) est l&#39;étape cruciale dans la recherche, l&#39;optimisation et la sélection des échantillons de haute résolution collecte de données par cryo-EM. Nous décrivons ici les étapes fondamentales de l&#39;identification à la fois vaste et ordonné, ainsi que de petits tableaux 2D, qui peut potentiellement fournir des informations essentielles pour l&#39;optimisation des conditions de cristallisation. En travaillant avec différents grossissements les EM, les données sur une gamme de paramètres critiques est obtenue. Faible grossissement fournit de précieuses données sur la morphologie et la taille de la membrane. À forts grossissements, une éventuelle dimension de cristal de commande et 2D sont déterminés. Dans ce context, il est décrit comment caméras CCD et en ligne des transformées de Fourier sont utilisés à forts grossissements pour évaluer protéoliposomes pour l&#39;ordre et la taille. Tandis que les cristaux 2D de protéines membranaires sont le plus souvent augmenté par reconstitution par dialyse, la technique de criblage est également applicable pour les cristaux produits à l&#39;aide de cristaux natifs monocouches, 2D, et des matrices ordonnées de protéines solubles. En outre, les méthodes décrites ici sont applicables à la projection de cristaux 2D de même plus petit ainsi que des protéines membranaires plus grandes, où les petites protéines nécessitent la même quantité de soins dans l&#39;identification que nos exemples et le treillis de grandes protéines pourraient être plus facilement identifiable aux premiers stades de la projection.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography at JoVE.com

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Évaluer bidimensionnelles (2D essais de cristallisation) pour la formation de réseaux classés protéine membranaire est une tâche difficile et très critique dans cristallographie électronique. Ici, nous décrivons notre approche dans le dépistage et l&#39;identification des cristaux 2D de protéines membranaires principalement des petites de l&#39;ordre de 15 - 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

assessing-two-dimensional-crystallization-trials-small-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vues.  Georgia Institute of Technology. Évaluer bidimensionnelles (2D essais de cristallisation) pour la formation de réseaux classés protéine membranaire est une tâche difficile et très critique dans cristallographie électronique. Ici, nous décrivons notre approche dans le dépistage et l'identification des cristaux 2D de protéines membranaires principalement des petites de l'ordre de 15 - 90kDa.

Vidéo: Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Impression par microcontact de protéines pour la biologie cellulaire

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Recherche

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisation de l&#39;ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...