Ce travail a été soutenu par une bourse de chercheur Burroughs Wellcome à YM et par une bourse de recherche postdoctorale Brown-Coxe de l&#39;Université Yale à MD.

Matériaux: <ul><li> Échantillon de protéine - lysozyme (50 mg / ml) </li><li> Goutte suspendue de 24 puits Bac </li><li> Assis chute de 24 puits, Bac </li><li> Cristallisation Microbatch 96 plateau bien </li><li> Solutions de cristallisation (soit commerciales disponibles ou fait maison) </li><li> Graisse silicone </li><li> Seringue de 5 mL sans luer-lock </li><li> Diapositives couvrent siliconé </li><li> Ruban adhésif optique </li><li> Paraffine </li><li> 0,1 à 2 uL micropipette avec une faible rétention de conseils </li><li> Pince à épiler </li><li> Lingettes professionnel </li></ul> 1. Accrochage / assis procédure Drop: <ol><li> Pour un premier écran, on peut utiliser des écrans disponibles dans le commerce qui exploitent la matrice creuse incomplète méthode factorielle des conditions d&#39;essai. La matrice creuse incomplète méthode factorielle est biaisée par et choisi parmi les conditions de cristallisation connus pour des macromolécules (Carter et Carter, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik et Kim, 1991;. Jancarik et al, 1991). Si la condition de cristallisation est déjà connu, un écran étroites peuvent être assemblés, faisant varier la concentration et le pH de précipitation autour du hit original. Le facteur déclenchant le plus souvent réussie est le polyéthylène glycol (PEG), suivi par le sulfate d&#39;ammonium. Ensemble, ces compte de deux facteurs déclenchants pour environ 60% de tous les facteurs déclenchants macromoléculaires enregistrés utilisés pour la cristallisation (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003). </li><li> Préparez vos solutions de cristallisation. Habituellement, ces conditions sont combinées à partir d&#39;un agent de précipitation, le sel d&#39;une certaine sorte et un tampon pour régler le pH. Dans certains cas, des additifs peuvent être ajoutés spécifiquement pour la protéine d&#39;intérêt. Toutes solution mère doit être filtrée à l&#39;aide filtre de 0,22 um. Certains de la solution stock pourrait être très visqueux (50% PEG, le glycérol, le PEG-MME, etc.) <ul><li> Préparer 1,5 mL de 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M de NaCl dans chacune des 0,1 M pH 4,0 NaOAc, 4.3, 4.6 et 4.9 (total de 24 solutions) </li></ul></li><li> Décongeler votre échantillon de protéine et de garder sur la glace. Stocks de protéines doivent être conservés à -80 ° C à moins que la protéine d&#39;intérêt est sensible au gel / dégel (si oui, conserver à 4 ° C). Les concentrations des protéines typiques sont de l&#39;ordre de 5-50 mg / mL, avec des concentrations plus élevées donnant généralement de meilleurs résultats. </li><li> Spin de l&#39;échantillon 15min/18, 000xg / 4 ° C - certaines protéines ont tendance à partiellement agrégées et précipiter après une étape de dégel. Ces agrégats peuvent favoriser la précipitation amorphes du reste des molécules de protéines donc tour complet vers le bas vous assurera que les molécules solubles dans votre échantillon. Gardez la protéine dans la glace jusqu&#39;à la mise en place du plateau. </li><li> Déterminer la concentration de protéines à partir de son absorbance à 280 nm en utilisant un spectrophotomètre UV. La concentration en protéines peut être calculé à partir de la lecture d&#39;absorbance et de coefficient d&#39;extinction de la protéine. Le coefficient d&#39;extinction peut être calculée avec l&#39;outil ProtParam sur le site Expasy: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> Remplir les puits de la pendaison de 24 puits / assis Bac goutte avec 500 ul de solution de précipitant selon le schéma de configuration de bac (figure 2B). Créer un anneau de graisse silicone sur le pourtour du puits. L&#39;anneau doit avoir un petit écart pour éviter toute accumulation de pression d&#39;air que le bien est scellé. En chute assis, il n&#39;est pas nécessaire pour la graisse car le bien est scellé avec du ruban adhésif (figure 2A). </li><li> Prenez une lame de couverture et nettoyez-le avec l&#39;air condensé par pulvérisation, ou un professionnel essuyez - la poussière évitant facilitera l&#39;interprétation de la chute de cristallisation et d&#39;éliminer les contaminations. Pour s&#39;asseoir gouttes, faites glisser la couverture ne sont pas utilisés. Au lieu de cela, le puits contient une étagère sur laquelle les protéines et les précipitants sont mélangés. </li><li> Mettez des volumes égaux de l&#39;échantillon de protéine et la solution retenue sur la lamelle. Différents volumes de protéines et de précipitants peuvent être jugés dans le cadre du processus d&#39;optimisation. En utilisant plus de protéines que les résultats précipitant dans une concentration nette de la protéine dans la goutte après l&#39;équilibration, qui peut être souhaitable pour les échantillons de protéines diluées, et de ralentir la nucléation des cristaux ou de croissance. Toute autre substance non volatile dans la solution baisse sera également concentré par le même facteur. Lorsque la protéine de pipetage et de solutions réservoir sur la lamelle, être extrêmement prudent afin d&#39;éviter la formation de bulles. Cela se produit souvent lorsque l&#39;air est soufflé hors de la pipette. <ul><li> Goutte suspendue: Charge 2 ul de 50 mg / ml de lysozyme dans 0,02 M pH 4,9 NaOAc au centre de la lamelle et ajouter à cela 2 ul de la solution retenue. </li><li> Assis déposer: Charge 2 ul de 50 mg / ml solution de lysozyme au centre du plateau et y ajouter 2 ul de la solution retenue. </li></ul></li><li> Retournez délicatement la lamelle et il se coucha sur le ring de la graisse sur le dessus du puits. Appuyez doucement pour que l&#39;air peut s&#39;échapper du puits grâce à l&#39;encoche de la graisse à praccumulation de pression d&#39;air dans le cas bien et garder le bien scellée. Accumulation de pression d&#39;air dans le puits peut soulever la lamelle, compromettre l&#39;étanchéité du puits. Dans la méthode de la goutte assise, optiquement clair bande transparente est utilisée pour couvrir les puits. Ainsi, dans cette méthode de scellement aura lieu chaque ligne / colonne. </li><li> Passez à la même suivant jusqu&#39;à bac est complet. </li><li> Vérifiez le bac lors de la configuration - en éliminant les particules de poussière et autres impuretés peuvent réduire l&#39;identification de faux positifs de cristaux de protéines. </li><li> Utiliser une feuille de pointage pour documenter votre expérience. </li><li> Placez le plateau à la température d&#39;incubation désirée, généralement entre 4 ° C et la température ambiante. 20 ° C est le plus souvent couronnée de succès. Prenez soin de manipuler le plateau doucement et éviter toute secousse. Soyez prudent lors de l&#39;ouverture et la fermeture de la porte de l&#39;incubateur. Des vibrations ou des variations de température pendant le transfert ou l&#39;incubation peut empêcher la croissance des cristaux ou de nuire à la qualité de cristal. Un matériau absorbant les chocs (mousse d&#39;emballage, par exemple) peut être utilisé comme rembourrage sous les plateaux de cristal. </li><li> Vérifiez le bac pour les cristaux de la journée suivante, puis tous les quelques jours, toujours la manutention et les plateaux avec soin. Document de ses constatations et des morphologies déposer dans une feuille de pointage bac spécifique. Cristaux prennent habituellement 2-5 jours à apparaître, bien que des cristaux apparaissent parfois beaucoup plus tôt (presque immédiatement) ou plus tard (jusqu&#39;à plusieurs mois!). Une fois les conditions de cristallisation ont été identifiés et le taux de croissance des cristaux est connu, il est préférable de laisser les bacs intact jusqu&#39;à cristaux sont apparus et ont grandi à au moins la moitié de leur taille finale. Laissant les plateaux intactes peut réduire le nombre d&#39;événements nucléation des cristaux, d&#39;où la production de petits nombres de gros cristaux. </li></ol> 2. Microbatch procédure: <ol><li> Échantillon de la protéine et la préparation précipitants sont décrits ci-dessus. </li><li> Air de pulvérisation d&#39;un plateau microbatch nouvelles pour éviter la poussière et autres particules de grande taille. </li><li> Dans le bac microbatch, remplir d&#39;huile de paraffine jusqu&#39;à 3 mm de haut (juste assez pour couvrir les puits). Supprimer l&#39;accès de l&#39;huile. </li><li> Charge 1 uL de solution de protéines (50 mg / ml de lysozyme) dans l&#39;huile pré-remplie ainsi - assurez-vous de la pipette la solution directement au fond du puits (figure 2A). </li><li> Charge 1 ul de solution de précipitant dans la fonction ainsi au régime configuration de bac (figure 2B) - assurez-vous que la chute coule au fond du puits et fusionne avec la gouttelette de protéine. </li><li> Déplacer vers le bien suivant jusqu&#39;à bac est complet. </li><li> Suivez les étapes 11-14 de la pendaison / assis drop procedure. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: La cristallisation est généralement dénommé le goulot d&#39;étranglement cristallographie aux rayons X. Une matrice creuse incomplète écran factorielle des conditions de précipitation de produit typiquement beaucoup de différents types d&#39;agrégation des protéines et des précipitations, parmi eux de grands cristaux simples. Si les concentrations de la protéine ou précipitants sont trop élevés, on peut voir la matière brune avec aucune forme distincte et la taille (précipitations amorphe). Quand la solution est sous-, la baisse sera souvent complètement clair et dépourvu de tout type de précipitations. La figure 3 montre plusieurs exemples de phénomènes de précipitation et de cristaux (Dessau et al., 2006). Phénomènes de précipitation Plus à l&#39;interprétation plus détaillées peuvent être trouvées au <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Le principe de la cristallisation des protéines. Le principe de la cristallisation des protéines. Dans une expérience de diffusion de vapeur (A) des volumes égaux de précipitant et en protéines sont présentes dans la goutte. L&#39;eau va diffuser à la fois et le précipitant et de la concentration de protéines sera doublé jusqu&#39;à ce qu&#39;un équilibre soit atteint entre la goutte et la solution retenue. Dans la cristallisation du lot (B) la concentration de protéines précipitant et ne changent pas pendant l&#39;expérience. Point A - Protéines reste sous saturée pas de cristaux peuvent être formés, Point B - nucléation des protéines se produisent, des cristaux commencent à se former et la concentration de protéine en solution tombe à saturation. C Point - Protéines précipités, mais les cristaux peuvent encore croître. La cristallisation de dialyse (C) en utilisant un gel capillaire branchés. Cristaux apparaissent comme le sel se diffuse hors de l&#39;échantillon de protéines (et / ou diffuse précipitant dans l&#39;échantillon de protéines) à travers le bouchon de gel. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Aperçu des caractéristiques des expériences de cristallisation des protéines. (A) les procédures pour suspendre la diffusion de vapeur chute, assis chute de la diffusion de vapeur, et la cristallisation des protéines microbatch. Dans chaque cas, un petit volume d&#39;échantillon de protéine concentrée est mélangée avec un volume égal ou plus petit des precipitansolution de t et s&#39;équilibrer. (B) pour la cristallisation du lysozyme de poulet, un plateau de 24 puits est mis en place avec diverses concentrations de chlorure de sodium (précipitant) et à 0,1 M acétate de sodium comme le tampon à différents pH (4.0 - 4.9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Résultats typiques d&#39;une expérience de cristallisation des protéines. (A) précipitations Amorphe. Lorsque la protéine ou précipitants (ou les deux) sont en forte concentration. (B) La séparation de phase. Protéines ou de détergent peuvent se séparer d&#39;une phase différente lorsqu&#39;il est mélangé avec certains facteurs déclenchants à forte concentration. (C) des cristaux de protéines en forme de Rod AtCSN7 obtenus en polyéthylène glycol 8000 et l&#39;acétate de magnésium (Dessau et al., 2006). (D) les cristaux obtenus dans lysozyme 1,0 M de NaCl et acétate de sodium pH 4,9. (E) Sous gouttes saturées restent généralement claire. Photographie par Moshe Dessau.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

Dans cet article nous décrire et démontrer générale protocoles actuels pour la cristallisation des protéines. Comme il une procédure en plusieurs étapes il ya quelques considérations, il faut être conscient. Lorsque vous travaillez avec de très petits volumes (0.5-2 uL), le séchage de la baisse due à l&#39;évaporation est une préoccupation majeure. Par conséquent, il est recommandé de travailler dans un environnement bien contrôlé (avec faible débit d&#39;air, une humidité élevée et un contrôle ri...

<table border="1">
		<tbody>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>L6876-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well VDX Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-142</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well Cryschem Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-158</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dow Corning Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Siliconized glass circle coverslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-231</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>100% paraffin oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-411</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-511</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-098</td>
<td>&nbsp;</td>	</tr>	</tbody>
		</table>

protein crystallization for x-ray crystallography

Utilisation de la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques de déduire comment ils fonctionnent est l&#39;un des domaines les plus importants de la biologie moderne. La disponibilité des structures de résolution atomique fournit une compréhension profonde et unique de la fonction des protéines, et les aide à démêler les rouages ​​internes de la cellule vivante. À ce jour, 86% de la Protein Data Bank (RCSB-PDB) sont entrées structures macromoléculaires qui ont été déterminés en utilisant cristallographie aux rayons X. Pour obtenir des cristaux appropriés pour des études cristallographiques, la macromolécule (par exemple protéines, acides nucléiques, protéines-protéines complexes ou de protéines nucléiques complexes acide) doit être purifiée à l&#39;homogénéité, ou aussi près que possible de l&#39;homogénéité. L&#39;homogénéité de la préparation est un facteur clé dans l&#39;obtention de cristaux qui diffractent à haute résolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999). Cristallisation nécessite apportant la macromolécule à la sursaturation. L&#39;échantillon devrait donc être concentré à la concentration la plus élevée possible sans causer d&#39;agrégation ou une précipitation de la macromolécule (généralement 20 à 50 mg / mL). Présentation de l&#39;échantillon à l&#39;agent de précipitation peut favoriser la nucléation des cristaux de protéines dans la solution, qui peut résulter en grande en trois dimensions la croissance de cristaux de la solution. Il existe deux techniques principales pour obtenir des cristaux: la diffusion de vapeur et de la cristallisation par lots. Dans la diffusion de vapeur, une goutte contenant un mélange de solutions précipitant et de protéine est scellé dans une chambre avec précipitant pur. La vapeur d&#39;eau diffuse alors hors de la baisse jusqu&#39;à ce que l&#39;osmolarité de la goutte et le précipitant sont égaux (figure 1A). La déshydratation de la chute provoque une lente concentration de protéines et de précipitant jusqu&#39;à ce qu&#39;un équilibre soit atteint, idéalement dans la zone de nucléation des cristaux du diagramme de phase. La méthode repose sur lots portant les protéines directement dans la zone de nucléation par la protéine de mélange avec la quantité appropriée de précipitant (figure 1B). Cette méthode est généralement réalisée sous une paraffine / mélange d&#39;huile minérale afin de prévenir la diffusion de l&#39;eau hors de la goutte. Ici, nous allons montrer deux types de montage expérimental pour la diffusion de vapeur, goutte suspendue et déposer assis, en plus de la cristallisation par lots dans l&#39;huile.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Crystallization for X-ray Crystallography at JoVE.com

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

La structure 3-D d&#39;une molécule donne une compréhension unique de la façon dont les fonctions molécule. La principale méthode de détermination de la structure au quasi-atomique résolution est cristallographie aux rayons X. Ici, nous montrons les méthodes actuelles pour l&#39;obtention de trois dimensions des cristaux de toute macromolécule donnée qui conviennent pour la détermination de structure par cristallographie aux rayons X.

Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.0K vues.  Yale University. La structure 3-D d'une molécule donne une compréhension unique de la façon dont les fonctions molécule. La principale méthode de détermination de la structure au quasi-atomique résolution est cristallographie aux rayons X. Ici, nous montrons les méthodes actuelles pour l'obtention de trois dimensions des cristaux de toute macromolécule donnée qui conviennent pour la détermination de structure par cristallographie aux rayons X.

Vidéo: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Non-invasive visualisation 3D avec résolution submicronique utilisant synchrotron à rayons X-tomographie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Recherche

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

Impression 3D préclinique X-ray tomodensitométrie Définit données

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...