Nous remercions les membres actuels et anciens du laboratoire Rubenstein pour fournir un environnement de recherche et enthousiaste. Nous remercions Ryan T. Gibson pour l&#39;assistance dans l&#39;optimisation de protocole. Nous remercions Mark Hochstrasser (Université de Yale) et Dieter Wolf (Universität Stuttgart) pour les souches de levures et plasmides. Nous remercions nos lecteurs anonymes pour leur aide dans l&#39;amélioration de la clarté et l&#39;utilité de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche de la section de l&#39;Université Ball State de Sigma Xi à SGW, un National Institutes of Health subvention (R15 GM111713) au DME, une bourse de recherche de Ball State University aspirent à DME, et les fonds de l&#39;Université Ball State Bureau du prévôt et Département de biologie.

1. levure croissance essai pour identifier des mutants candidats défectueux dans la dégradation des protéines <ol><li> Transform de type sauvage et des cellules de levure mutantes avec un plasmide codant pour une protéine fusionnée instable, en cadre, à une enzyme reporter métabolique. </li><li> Ensemencer transformants dans 5 ml de synthèse défini (SD) de milieu minimal qui est sélectif pour les cellules portant des molécules plasmidiques. Incuber pendant une nuit à 30 ° C, en rotation. </li><li> Mesurer la densité optique à 600 nm (DO600) de chaque culture d&#39;une nuit. REMARQUE: Après incubation pendant une nuit, les cellules en culture peut être soit en phase de croissance logarithmique ou stationnaire, mais devrait avoir atteint une DO 600 de 0,2 minimal. Souches de levure à croissance très lente peuvent nécessiter des temps d&#39;incubation plus d&#39;une nuit, ou l&#39;inoculation d&#39;un plus grand nombre de cellules, tel que déterminé de manière empirique. </li><li> Préparer six dilutions en série de cellules de levure transformées dans une plaque à 96 puits stériles, à partir de cellules diluées à unen DO600 de 0,2. Placez chaque transformant de levure à doser dans un enregistrement différent de la plaque de 96 puits. <ol><li> Pour chaque transformant, on calcule le volume de culture d&#39;une nuit nécessaire pour diluer les cellules à une DO 600 de 0,2 dans un volume final de 200 ul. Ajouter ce volume de culture de la nuit à l&#39;puits correspondant dans la colonne 1. Ajouter la quantité appropriée de l&#39;eau stérile pour porter le volume à 200 pi. </li><li> Pour chaque ligne de la levure, ajouter 125 pi d&#39;eau stérile pour les puits dans les colonnes 2, 3 et 4. REMARQUE: des plaques à 96 puits stériles emballés individuellement peuvent être emballés avec des couvercles stériles. Les couvercles peuvent être utilisés comme réservoirs pour l&#39;eau stérile qui est répartie dans cette étape. Ceci permet un transfert simultané de l&#39;eau stérile à tous les puits dans une colonne donnée avec une pipette à canaux multiples. </li><li> Mélanger le contenu de la première colonne (levure diluée jusqu&#39;à une DO 600 de 0,2) par pipetage de haut en bas avec une pipette à canaux multiples. </li><li> Transfer 25 pi de levure de la colonne 1 à la colonne 2, en utilisant une pipette multicanaux. Mélanger en pipetant. Transfert 25 ul de la colonne 2 à la colonne 3, et 25 pi de la colonne 3 à la colonne 4 (en mélangeant bien à chaque étape). </li></ol></li><li> Mélanger chaque échantillon avec une pipette multicanaux. Partant de la plus diluée pour diluer moins colonnes de levure, une pipette 4 pi de chaque échantillon sur deux plaques contenant le milieu sélectif approprié. Utilisez une plaque avec un milieu qui maintient sélection de plasmide (cette plaque sert de taches de levure et le contrôle de la croissance). Utiliser une seconde plaque avec un milieu qui sélectionne pour le maintien du plasmide et l&#39;expression de la protéine instable fusionné à l&#39;enzyme rapporteur. Parce que la levure se installer rapidement, mélanger les cellules par pipetage de haut en bas à intervalles réguliers. NOTE: Séchoir plaques seront plus facilement absorber le liquide que les plaques fraîchement préparés et sont donc recommandés pour ces expériences. Plaques humides peuvent être séchés par incubation à température ambiante dans lol&#39;humidité w pour 1-2 jours ou incubations courtes dans une hotte à flux laminaire. Plaques peuvent sécher inégalement si le flux d&#39;air laminaire est parallèle à la magistrature. Utilisation d&#39;un gabarit, il est plus facile de repérer les cellules de levure à des distances régulières. Deux exemples de modèles sont fournis à la figure 1. Ceux-ci peuvent être imprimés, découpés et fixés à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri couvercle. </li><li> Permettre aux plaques à sécher sur la paillasse. </li><li> Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2-6 jours. </li><li> Photographier chaque plaque après incubation. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Figure 1. Modèles pour repérer des cellules de levure sur des plaques d&#39;agar de 100 mm. Ces modèles peuvent être utilisés pour faciliter repérer la levure à des distances régulières avec une pipette multicanaux. Les modèles peuvent être imprimés, découpés et fixés à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri couvercle. Placez boîte de Pétri avec la croissanceintérieur du couvercle moyenne avec modèle apposé. Les modèles sont marqués d&#39;une encoche pour suivre l&#39;orientation. Il est recommandé que les plaques utilisées dans des dosages de croissance être marqués de manière similaire avec une encoche pour suivre l&#39;orientation. Modèles pour repérer quatre (A) ou cinq (B) des dilutions en série de cellules de levure sont fournis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Se il vous plaît cliquez ici pour afficher une version imprimable de ce chiffre avec 100 mm modèles.</a> 2. Confirmation biochimique de croissance de la levure Assay <ol><li> La croissance des cellules de levure et d&#39;extraction de protéines post-alcaline (modifiée du 31) <ol><li> Transform de type sauvage et des cellules de levure mutantes avec un plasmide codant pour la protéine instable. </li><li> Ensemencer les transformants dans 5 ml de milieu SD qui est sélectif pour les cellules hébergeant molécules de plasmide. Incuber pendant une nuit à 30 ° C, en rotation. </li><li> Mesurer la DO 600 de chaque cu nuitlture. REMARQUE: Après incubation pendant une nuit, les cellules peuvent être soit en phase de croissance logarithmique ou stationnaire, mais devrait avoir atteint une DO 600 qui permettra dilution jusqu&#39;à une DO 600 de 0,2 à 10 ml de milieu sélectif frais (étape 2.1.4). Souches de levure à croissance très lente peuvent nécessiter des temps d&#39;incubation plus d&#39;une nuit, ou l&#39;inoculation d&#39;un plus grand nombre de cellules, tel que déterminé de manière empirique. </li><li> Diluer les cellules de levure à une DO 600 de 0,2 à 10 ml de milieu sélectif frais. </li><li> Continuer à incuber les cellules à 30 ° C, la rotation ou l&#39;agitant, jusqu&#39;à cultures atteignent une DO 600 entre 0,8 et 1,2 (ce est à dire sont en croissance mi-logarithmique). NOTE: Si la protéine d&#39;intérêt est instable sous le contrôle d&#39;un promoteur régulable, le moment optimal pour l&#39;induction de l&#39;expression de la protéine et la récolte des cellules peut varier selon les études antérieures ou des observations empiriques. </li><li> Recueillir 2,5 OD 600 unités de la culture dans un 15 ml coniqueal tuyau par centrifugation à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant par la pipette ou l&#39;aspiration. REMARQUE: Un DO600 unité est définie comme la quantité de levure présente dans 1 ml de culture à DO 600 de 1,0. Le volume de la culture (en ml) nécessaire pour récolter 2,5 OD 600 unités (V) peut être déterminée en utilisant l&#39;équation suivante: V = 2,5 unités DO 600 / DO mesurée 600 </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml d&#39;eau distillée. Transfert cellules en suspension dans un tube à centrifuger. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 6500 xg pendant 30 sec à température ambiante. Retirer le surnageant par la pipette ou l&#39;aspiration. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 pi d&#39;eau distillée à la pipette de haut en bas ou de vortex, et ajouter 100 ul NaOH 0,2 M. Mélanger en pipetant. Incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante. </li><li> cellules Pellet (dont la plupart ne ont pas encore libérés des protéines et sont encore viables) par centrifugation à 18 000 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant par la pipette ou l&#39;aspiration. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 50 - 100 pi de tampon d&#39;échantillon Laemmli 1x, qui lyser les cellules, par pipetage de haut en bas ou vortex. NOTE: L&#39;élimination du surnageant alcalin après la centrifugation et remise en suspension ultérieure des cellules dans du tampon d&#39;échantillon de Laemmli extrait de protéines à un pH compatible avec dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) en utilisant un système tampon de roulement Tris-glycine et western blotting. </li><li> Pour dénaturer complètement protéines, incuber les lysats à 95 ° C pendant 5 min. NOTE: Agrégation protéines-protéines exposées (par exemple avec plusieurs segments transmembranaires) peuvent devenir insolubles lorsqu&#39;ils sont incubés à 95 ° C. Par conséquent, les lysats doivent être incubées à des températures plus basses (par exemple 37 ° C - 70 ° C) pendant 10 à 30 min, comme déterminé empiriquement, pour l&#39;analyse de ces protéines. </li><li> Lysats frais en le plaçant sur la glace pendant 5 min. </li><li> Lysats centrifuger à 18 000 g pendant 1 min à température ambiante pour obtenir un culot insoluble. Séparer le surnageant (extrait de protéine solubilisée) par SDS-PAGE avant l&#39;analyse western blot ultérieure (section 2.2). Alternativement, lysats de conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Représentant Protocole Western Blot <ol><li> Charger le volume déterminé de manière empirique des lysats dans un gel de SDS-PAGE. </li><li> Exécuter gel à 200 V jusqu&#39;à ce que le colorant avant a atteint le fond du gel. </li><li> Transfert de protéines à partir de gel de fluorure de polyvinylidène (PVDF) par transfert humide à 20 V pendant 60 à 90 min à 4 ° C. </li><li> Bloquer membrane par incubation dans 5% de lait écrémé dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS), bascule, pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Décanter la solution de blocage. </li><li> Incuber la membrane avec l&#39;anticorps primaire spécifique pour la protéine d&#39;intérêt (ou épitope tag de celui-ci) dans 1% de lait écrémé dans du TBS avec 0,1% de Tween-20 (TBS / T) pendant 1 h à la salle température, bascule. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à la température ambiante, à bascule. NOTE: En raison fluorophores sont sensibles à la lumière, des dilutions d&#39;anticorps fluorophores conjugué doivent être préparés dans l&#39;obscurité. En outre, l&#39;incubation de membranes en présence d&#39;anticorps conjugué à un fluorophore doit se produire dans des récipients étanches à la lumière. Ceci peut être réalisé en enroulant plateaux d&#39;incubation dans de l&#39;aluminium. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Acquérir image de membrane en utilisant Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l&#39;équipement d&#39;imagerie comparables et logiciels), selon les recommandations du fabricant. </li><li> Après l&#39;imagerie membrane, incuber la membrane avec un anticorps primaire spécifique d&#39;une chargeing protéine de contrôle dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à température ambiante, à bascule. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à la température ambiante, à bascule. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Acquérir image de membrane en utilisant Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l&#39;équipement d&#39;imagerie comparables et logiciels), selon les recommandations du fabricant. </li></ol></li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

La méthodologie présentée ici permet la détermination rapide et confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans des cellules de levure. Ces expériences mettent en évidence l&#39;utilité et la puissance de la levure comme modèle organisme eucaryote (plusieurs excellentes critiques de levure biologie et compilations de protocoles pour la manipulation, le stockage et la manipulation de cellules de levure (par exemple 41-44) sont disponibles pour les e...

La dégradation sélective des protéines est essentielle à la vie eucaryote, et la dégradation de la protéine altérée contribue à un certain nombre de maladies, y compris plusieurs types de cancer, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, et la fibrose kystique 1-5. Le système ubiquitine-protéasome (UPS), qui catalyse la dégradation sélective des protéines, est une cible thérapeutique émergeant de ces conditions 6-10. ubiquitine ligases attachent de manière covalente des polymères de l&#39;acide 76-ubiquitine aminés aux protéines 11. Les protéines qui ont été marqués avec des chaînes de polyubiquitine sont reconnus et protéolysée par les ~ 2,5 mégadaltons protéasome 26S 12. Études initiées dans l&#39;organisme eucaryote modèle Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe) ont été fondamental dans l&#39;élucidation des mécanismes de dégradation des protéines dans les cellules eucaryotes. Le premier substrat physiologique démontré de l&#39;onduleur était la levure répresseur transcriptionnel MATα2 13, 14, et de nombreux composants hautement conservées de la première UPS ont été identifiés ou caractérisés dans la levure (par exemple 15-26). Les découvertes faites dans cet organisme modèle polyvalent et génétiquement traitable sont susceptibles de continuer à fournir des informations importantes sur les mécanismes conservés de la dégradation des ubiquitine. Reconnaissance et de la dégradation de la plupart des substrats UPS requièrent une action concertée de plusieurs protéines. Par conséquent, un objectif important dans la caractérisation de la dégradation régulée d&#39;une protéine donnée est instable pour déterminer les exigences génétiques pour la protéolyse. Les approches classiques (par exemple pulse-chase et expériences cycloheximide-chase 27) pour surveiller la dégradation des protéines dans des cellules de mammifère ou de levure sont laborieuses et prennent du temps. Bien que ces types de méthodologie fournissent des moyens très sensibles pour détecter la dégradation des protéines, ils ne conviennent pas pour l&#39;analyse rapide de la dégradation des protéines ou à grande échelle screening pour les mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, une analyse basée sur la croissance de la levure pour l&#39;identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines instables est présentée. Dans la méthode de la croissance de la levure pour l&#39;analyse de la dégradation des protéines, une protéine instable d&#39;intérêt (ou un signal de dégradation) est fusionnée, en cadre, à une protéine qui est nécessaire pour la croissance de la levure dans des circonstances particulières. Le résultat est un substrat artificiel qui peut servir comme un outil puissant pour déterminer les exigences génétiques de la dégradation des protéines de la protéine d&#39;intérêt instable. Idéalement, les souches de levure de laboratoire les plus couramment utilisés abritent un panel de mutations dans les gènes codant pour des enzymes métaboliques impliquées dans la biosynthèse de certains acides aminés ou de bases azotées (par exemple, 20,28-30). Ces enzymes sont essentiels pour la prolifération cellulaire en l&#39;absence de métabolites dans exogène prévues dont la synthèse des enzymes participent. Telenzymes métaboliques peuvent ainsi fonctionner comme rapporteurs basées sur la croissance de la dégradation des protéines instables à laquelle ils sont fusionnés. Les exigences génétiques pour la dégradation des protéines peuvent être aisément élucidés, puisque des mutations qui empêchent la protéolyse permettront cellules hébergeant le reporter de dégradation de se développer dans des conditions sélectives. Un avantage de croissance est une indication indirecte qu&#39;une mutation particulier augmente l&#39;abondance de la protéine d&#39;intérêt. Cependant, l&#39;analyse biochimique directe est nécessaire pour confirmer qu&#39;une mutation permet la croissance à travers des niveaux accrus en protéines plutôt que par des causes indirectes ou artefacts. L&#39;effet d&#39;une mutation sur la protéine abondance peut être confirmée par analyse western blot des niveaux de protéines à l&#39;état stable dans les cellules qui font et ne abritent la mutation particulière. Procédé pour l&#39;extraction rapide et efficace de protéines de levure (incubation séquentielle de cellules de levure avec de l&#39;hydroxyde de sodium et un tampon échantillon) sous une forme adaptéepour analyse par western blot est également présenté 31. Ensemble, ces expériences faciliter l&#39;identification rapide des régulateurs de candidats de la dégradation des protéines.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#39;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#39;s laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC264571000</td>
			<td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088726001</td>
			<td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-32</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>51028068</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-0450</td>
			<td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14403</td>
			<td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14401</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate imaging system (e.g. 
			Gel Doc XR+ System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8195</td>
			<td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Dri-Bath Heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1172011AQ</td>
			<td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>459250</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

La dégradation des protéines réglementé est crucial pour pratiquement toutes les fonctions cellulaires. Une grande partie de ce qui est connu sur les mécanismes moléculaires et génétiques exigences pour la dégradation des protéines eucaryotes a été initialement créé en Saccharomyces cerevisiae. Analyses classiques de la dégradation des protéines se sont appuyés sur pulse-chase et cycloheximide-chase méthodes biochimiques. Bien que ces techniques fournissent des moyens sensibles pour observer la dégradation des protéines, ils sont laborieux, de temps, et à faible débit. Ces approches ne sont pas aptes à la sélection rapide ou à grande échelle pour des mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, un test basé sur une croissance de la levure pour l&#39;identification facile des exigences génétiques pour la dégradation des protéines est décrite. Dans ce dosage, une enzyme rapporteur nécessaire à la croissance dans des conditions sélectives spécifiques est fusionnée à une protéine instable. Les cellules dépourvues de l&#39;enzyme rapporteur endogène mais qui expriment la protéine de fusion peut se développer sous sélective conditions que lorsque la protéine de fusion est stabilisé (lorsque la dégradation des protéines est compromise). Dans l&#39;essai de croissance décrit ici, des dilutions en série de type sauvage et des cellules de levure mutantes qui hébergent un plasmide codant pour une protéine de fusion sont déposés sur un milieu sélectif et non-sélectif. Croissance dans des conditions sélectives est compatible avec la dégradation dépréciation par une mutation donnée. L&#39;abondance de la protéine accrue devrait être confirmé biochimiquement. Procédé pour l&#39;extraction rapide de protéines de levure sous une forme appropriée pour l&#39;électrophorèse et transfert de Western est également démontrée. Une lecture basée sur la croissance pour la stabilité de la protéine, combinée avec un simple protocole d&#39;extraction de protéines pour l&#39;analyse biochimique, facilite l&#39;identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d&#39;une variété de protéines de courte durée. Dans l&#39;exemple présenté, l&#39;enzyme His3, qui est nécessaire pour la biosynthèse de l&#39;histidine, a été fusionnéà DEG1 -Sec62. DEG1 -Sec62 est prévue pour dégradation après ce qu&#39;il se engage aberrante le réticulum endoplasmique translocon. Cellules hébergeant DEG1 -Sec62-His3 sont capables de croître dans des conditions sélectives lorsque la protéine a été stabilisé.

Pour illustrer cette méthode, l&#39;enzyme His3 a été fusionné à l&#39;extrémité carboxy-terminale du modèle réticulum endoplasmique (RE) associée au gène de dégradation (ERAD) substrat, DEG1 -Sec62 (figure 2A) pour créer DEG1 -Sec62-His3 (Figure 3) . DEG1 -Sec62 représente un membre fondateur d&#39;une nouvelle classe de substrats ERAD qui sont ciblées suivant, les association persistante aberrante avec le translocon, le canal principal respons...

Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.6K vues.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Vidéo: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Recherche

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.