Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Buchholz et le Sigma-Aldrich ARNi équipe pour la discussion. Nous tenons à remercier la Société Max Planck et le Bundesministerium für Bildung und Forschung Grands Allez-Bio [0315105] pour le soutien. MISSION ® est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP

1. Haute qualité des bibliothèques esiRNA MISSION <ol><li> Pour chaque gène d&#39;intérêt de la région cible la plus sensible et spécifique pour l&#39;ARNi est choisi en utilisant l&#39;algorithme DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. Scores DEQOR le potentiel de tous les faire taire 21 nucléotides possibles siRNA longtemps dans une cible basée sur l&#39;ARNm état ​​de l&#39;art design 4-contraintes. En outre, chaque siARN potentiel est analysé pour d&#39;éventuelles réactions croisées avec d&#39;autres gènes en effectuant une recherche BLAST contre le transcriptome de l&#39;organisme étudié. Le programme fournit ainsi une analyse de la qualité globale et transversale de silençage capacités des esiRNA potentiels (300-600 longueur pb). </li><li> La région choisie du gène cible d&#39;ADNc est amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques de gènes flanqués de bactériophages ARN-polymérase-promoteur séquences. </li><li> Chaque produit de PCR utilisées pour la production esiRNA MISSION est vérifié pour l&#39;identité par séquençage et de la pureté par Caliper LabChip analyse. </li><li> Longue ARN double brin sont transcrits à partir du produit de PCR par l&#39;ARN polymérase, suivie d&#39;un recuit des brins transcrits. </li><li> esiRNAs sont préparés par digestion enzymatique limitée de la longue ARN double brin à l&#39;aide RNaseIII suivie d&#39;une purification par chromatographie échangeuse d&#39;anions en utilisant colonnes de centrifugation Q-sépharose. </li><li> esiRNAs sont précipités et remis en suspension dans du tampon TE. Le rendement est mesuré par absorption UV des mesures et la concentration est ajustée par dissolution dans un volume approprié de tampon TE. La qualité globale du produit final est contrôlé par Caliper LabChip analyse. </li></ol> 2. Choisir une lignée cellulaire et l&#39;optimisation de la transfection pour le dépistage <ol><li> Titrer quantités d&#39;esiRNA (utilisation Eg5 comme positive et Renilla-luciférase comme témoin négatif) et l&#39;augmentation des quantités de réactifs de transfection dans une plaque de 384 puits, ajouter des cellules et incuber pendant 48 heures. Eg5 est une protéine motrice kinésine nécessaire à l&#39;assemblage du fuseau bipolaire et l&#39;épuisement conduit à un arrêt de la mitose. Répétez cette procédure pour différents réactifs de transfection et les lignées cellulaires. Ici, nous utilisons des cellules HeLa cultivées en suivant les procédures standard et oligofectamine (Invitrogen) comme réactif de transfection. </li><li> Pour choisir les conditions optimales de transfection compter les cellules transfectées avec Eg5 esiRNAs qui montrent un arrêt de la mitose (forme ronde) et le nombre total de cellules transfectées avec Renilla-luciférase (Rluc) esiRNA par microscopie optique. Choisissez la condition avec le moins de toxicité pour Rluc et le phénotype le plus prononcé pour les Eg5. Une méthode alternative pour l&#39;optimisation des conditions de transfection implique une lignée cellulaire stable exprimant l&#39;EGFP (ou un autre gène rapporteur approprié) sous le contrôle d&#39;un promoteur constitutif actif. Après transfection d&#39;un esiRNA contre EGFP (ou un autre gène rapporteur) et Rluc (ou un autre contrôle approprié esiRNA négatif) de mesurer le knock-down efficacité et la toxicité, par exemple par tri cellulaire par fluorescence assistée (FACS). Assurez-vous que le esiRNA utilisé pour EGFP est parfaitement complémentaire de la cible d&#39;ARNm. </li></ol> 3. Configuration de l&#39;écran primaire 5,6 <ol><li> Optimiser la précision de pipetage pour tous les composants utilisés sur une station de pipetage automatique (par exemple, le Verseau, Tecan et WellMate, Matrix). Parce que les paramètres de pipetage changer selon le type de type de solution, le volume et la plaque de cette optimisation doit être répétée pour chaque étape séparément. Si possible, la station de pipetage doit être placé sous une hotte à flux laminaire pour éviter les contaminations. Tous les composants utilisés doivent être désinfectés avant usage, soit par autoclavage le cas échéant, ou par pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 75%. Optimiser les protocoles de lavage de telle sorte que la contamination croisée du puits à bien exclu. Détails pour l&#39;optimisation de pipetage automatique ne peut pas être donner de l&#39;espace-contraintes et dépendent largement de la station de pipetage utilisée. Pour plus d&#39;informations reportez-vous à la fabrique du protocole. </li><li> Cellules Transfecter en format de 384 puits en utilisant les conditions optimisées d&#39;en haut avec esiRNAs d&#39;Eg5 et Rluc. Utiliser un modèle alternatif pour Eg5 et Rluc esiRNA couvrant toute la plaque. </li><li> Après une incubation de 48 heures fixer les cellules avec de l&#39;éthanol 100% froid, réhydrater dans du PBS pendant 15 minutes, une teinture pendant 25 minutes dans du PBS contenant 1 ug / ml DAPI et 100 pg / ml de RNase A (Qiagen). Enfin laver avec du PBS et stocker à 4 ° C. </li><li> Mesure de l&#39;intensité de fluorescence DAPI-par exemple par la microscopie sur un système Olympus scanR. Générer un histogramme en traçant l&#39;intensité DAPI contre le nombre de cellules et d&#39;évaluer la distribution du cycle cellulaire en calculant le pourcentage de cellules avec l&#39;ADN contenu 2N pour G1-phase; &lt;2N&gt; 4N pour la phase S; 4N pour G2/M-phase et &gt; 4N de l&#39;aneuploïdie / polyploïdie. </li><li> Evaluer l&#39;homogénéité des résultats sur la plaque. Une optimisation plus poussée est nécessaire si les résultats diffèrent de façon significative la position d&#39;exclure EFFEcts. Un problème commun lors de l&#39;utilisation plaques multi-puits est l&#39;évaporation accrue au niveau des puits bord pendant la durée d&#39;incubation. Cela conduit à différentes conditions expérimentales dans différents puits, qui se traduit souvent par la plaque-position des effets spécifiques. Pour cette raison, nous recommandons de laisser tous les puits vides bord d&#39;un écran. Pour réduire davantage l&#39;évaporation de s&#39;assurer que les incubateurs sont maintenus à une humidité élevée. Nous avons également régulièrement emploient des obstacles tels que l&#39;évaporation de bandes d&#39;étanchéité Corning respirant qui bloque l&#39;évaporation. Aussi les ressources d&#39;autres effets de position doivent être pris en considération, par exemple, la variation technique du système de lecture (microscope, un lecteur de plaques, etc) ou des variations dans la manipulation de liquides (gradients, inhomogénéité de solutions, etc.) </li><li> Les différences statistiques entre les contrôles positifs et négatifs de fournir une mesure de l&#39;importance du test employé. Une grande différence entre le contrôle négatif (ou bruit de fond; maquette de contrôle) et l&#39;échantillon doit être établie avant de commencer le dépistage du réel. Une bonne mesure de la signification statistique est le facteur Z. Le facteur Z est calculé selon l&#39;équation: Z = 1 - (3 SD [échantillon] + 3 SD [maquette]) * (| Av. [échantillon] - Av. [maquette] |) -1; avec SD: déviation standard; Av.: moyenne. Un facteur Z de 1&gt; Z&gt; 0,5 indique une séparation significative des contrôles négatifs (et le bruit) des contrôles positifs 7. </li></ol> 4. L&#39;écran principal <ol><li> Préparer plaques 384 puits de culture tissulaire pour la transfection des esiRNAs utilisant les conditions optimisées par le haut. Ici, nous utilisons esiRNA 15ng par puits dissous dans un tampon TE 5uL. Au moins huit postes de contrôle par plaque doit être chargé avec adaptés contrôles positifs et négatifs pour le processus biologique étudié (ici: Eg5 et Rluc). Pour éviter les effets de position des puits bord sont chargés avec 5uL tampon TE seulement. </li><li> Ajouter 5uL OptiMEM (Invitrogen) contenant Oligofectamine 0.2μl par puits, mélanger et laisser incuber pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter suspension cellulaire sur le mélange de transfection (ici: 40μl d&#39;une suspension de cellules HeLa à 25 cellules / ul de concentration; équivalent à 1000 cellules par puits) et incuber pendant 72 heures. </li><li> Mesurer l&#39;ADN contenu sur un microscope automatisé (Olympus scanR, voir ci-dessus). Évaluer à l&#39;aide du Z-score de statistiques pour la sélection de hit: Z-scores sont calculés pour l&#39;ensemble de l&#39;échantillon esiRNAs utilisant le signal pour le contrôle négatif comme référence. Remarque, le Z-score n&#39;est pas le même que le Z-facteur. Z-scores de fournir une mesure statistique pour la signification des valeurs de l&#39;échantillon en comparaison à un contrôle (maquette). Elle est calculée suivant l&#39;équation: Z = (valeur [Exemple] - moyenne [maquette]) * écart-type [maquette] -1. Pour la sélection touché un seuil doit être appliquée. Typiquement, un critère d&#39;importance comme: 2 &lt;Z &lt;-2 est utilisé, mais en fonction de la qualité des données, le processus biologique étudié ou simplement la portée de l&#39;écran, différents seuils peuvent être applicables. A côté de la assez facile Z-score statistiques font également plus élaborées des méthodes d&#39;évaluation mathématiques peuvent être utilisées (une première dans l&#39;intérieur du vaste champ de l&#39;évaluation statistique des données du dépistage peuvent être trouvés dans Malo et al. 8). </li></ol> 5. L&#39;écran secondaire et la validation frappé <ol><li> Un écran secondaire suit l&#39;écran principal d&#39;éliminer les faux positifs dus à des erreurs expérimentales ou effets hors-cible. Pour les hits choisis la même procédure utilisée dans l&#39;écran principal devrait être répétée pour un plus grand nombre de répétitions (3-5) pour permettre une meilleure évaluation statistique. </li><li> Pour frappe vérifié un esiRNA secondaire non-cumul (ou un autre déclencheur taire non-cumul) à l&#39;encontre des objectifs identifiés dans les écrans initiale devrait être utilisée. Le même dosage et la lecture doit être appliqué que pour l&#39;écran principal. </li><li> Finalement, les gènes sélectionnés peuvent être validées par inter-espèces de secours ARNi 9. Ainsi un chromosome bactérien artificiel (BAC) d&#39;encodage par exemple l&#39;orthologue de la souris du gène est transfectées de façon stable dans les cellules. BAC-construit de préserver un gène dans son contexte génomique et de permettre une expression quasi-physiologiques. ARNi contre le gène endogène humain va quitter l&#39;expression du transgène de souris inaltéré qui sauve le RNAi-phénotype. ARNi de sauvetage fournit l&#39;étalon-or pour la vérification des phénotypes ARNi disponibles à ce jour. </li><li> Enfin, les candidats validés sont étudiés plus en détail pour éventuellement tirer compréhension mécaniste. Dans de nombreux cas l&#39;ARNi peut être utilisée dans ces expériences, par exemple dans le secondaire, les tests plus élaborés. </li></ol>

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	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

Auteurs de déclarer des relations financières avec des entités commerciales qui pourraient avoir un intérêt dans le travail présenté.

Interférence ARN est devenue une technique standard pour étudier la perte de fonction des phénotypes. À grande échelle des collections de l&#39;ARNi médiateurs sont disponibles auprès de différents fournisseurs et de fournir une méthode simple, efficace et rapide pour le gène de silençage. Cela a ouvert la porte pour le dépistage systématique des acteurs-clés dans de nombreux processus biologiques permettant une perspective échelle du génome sur un large éventail d&#39;espèces différentes et de types cellulaires. Taux élevé de faux positifs et de faux négatifs sont un défi commun dans les écrans de l&#39;ARNi. Pour résoudre ce problème, des efforts considérables ont été investis pour améliorer l&#39;efficacité et en particulier de la spécificité de la réduction au silence des déclencheurs. Une découverte importante est que d&#39;une piscine de siRNA ciblant différents la même transcription améliore considérablement la spécificité cible. Parce que d&#39;une piscine très complexe de siRNA différent est produit par le endoribonucléase, esiRNAs sont élevés déclenche une spécificité de ciblage, réduire le taux de faux positifs dans les écrans de l&#39;ARNi. esiRNAs ont également démontré pour atteindre passes rabattues efficace, de réduire également le taux de faux négatifs. Parce écrans ARNi sont techniquement exigeants, ils vont probablement rester difficiles à réaliser sur une base régulière pendant un certain temps. Cependant, comme les réactifs et les instruments se laboratoires mieux et plus partager leur expertise, l&#39;utilisation d&#39;écrans ARNi dans la biologie moderne sont réputés pour augmenter à l&#39;avenir.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

L&#39;interférence ARN (ARNi) est un mécanisme cellulaire de base pour le contrôle de l&#39;expression génique. L&#39;ARNi est induit par courts ARNs double brin également connu comme les petits ARN interférents (siRNA). Les courts ARN double-brin proviennent de plus à double brin par des précurseurs de l&#39;activité de Dicer, une protéine de la famille des RNases III de endonucléases. Les fragments résultants sont des composantes du complexe ARN-induite taire (RISC), il dirige à l&#39;ARNm cible apparenté. RISC clive l&#39;ARNm cible réduisant ainsi l&#39;expression de la protéine codée 1,2,3. L&#39;ARNi est devenue une méthode puissante et largement utilisée expérimentale pour la perte d&#39;études fonction des gènes dans les cellules de mammifères en utilisant de petits ARN interférents. Actuellement, deux méthodes principales sont disponibles pour la production de petits ARN interférents. Une méthode consiste à la synthèse chimique, tandis qu&#39;une autre méthode emploie un clivage endonucléolytique des cibles spécifiques à long ARN double brin par la RNase III in vitro. Ainsi, un bassin diversifié de siRNA-comme oligonucléotides est produit qui est également connu comme endoribonucléase préparés siRNA ou esiRNA. Une comparaison de l&#39;efficacité de siRNA chimiquement dérivées et esiRNAs montre que les deux déclencheurs sont puissants dans gène cible au silence. Les différences peuvent cependant être vu quand on compare la spécificité. Beaucoup seule siRNA synthétisés chimiquement produisent éminents effets hors-cible, tandis que le mélange complexe inhérente à esiRNAs conduit à un effet de choc plus spécifiques 10. Dans cette étude, nous présentons la conception de l&#39;échelle du génome bibliothèques esiRNA MISSION et son utilisation pour le dépistage RNAi illustrée par un écran d&#39;ADN contenu pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Nous montrons comment optimiser le protocole de transfection et le test de dépistage dans le haut débit. Nous avons également démontrer comment de grandes séries de données peuvent être évaluées statistiquement et présenter des méthodes pour valider frappe primaire. Enfin, nous donnons potentiels points de départ pour d&#39;autres caractérisations fonctionnelles des hits validés.

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Ici, nous utilisons une bibliothèque esiRNA homme dans un écran à haut débit pour les gènes impliqués dans la division cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et mener une esiRNA écrans, ainsi que la façon d&#39;analyser et de valider les résultats.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K vues.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Ici, nous utilisons une bibliothèque esiRNA homme dans un écran à haut débit pour les gènes impliqués dans la division cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et mener une esiRNA écrans, ainsi que la façon d'analyser et de valider les résultats.

Vidéo: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocole pour des essais de l&#39;ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Recherche

Biologie

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Livraison bactérienne de l&#39;ARNi Effectors: Transkingdom ARNi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d&#39;Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.