Le protocole actuel est important parce qu’il permet aux chercheurs de produire des nanoparticules chargées de siRNA et de caractériser adéquatement ces nanoparticules afin d’assurer leur aptitude à l’administration aux animaux avant des études ultérieures. L’avantage de cette approche est de produire des nanoparticules qui augmentent la biodisponibilité du siRNA et de produire des nanoparticules qui sont chargées de manière neutre et donc adaptées à l’administration systémique. Cette technique est perspicace parce que les nanoparticules de siRNA peuvent être appliquées pour traiter une myriade de maladies nécessitant l’administration systémique comprenant le cancer, la maladie cardio-vasculaire, et les désordres autoimmuns, entre autres.
Pour commencer, dissoudre le polymère dans l’éthanol à une concentration de 33,3 milligrammes par millilitre et remuer pour assurer la dissolution. Ensuite, utilisez une pipette pour transférer la solution polymère dans un tampon d’acide citrique de 10 millimlaires pour atteindre une concentration de 3,33 milligrammes par millilitre. Ajouter de l’eau distillée dans un tube contenant un petit ARN interférant pour atteindre une concentration de 50 micromolaires.
Mélanger le polymère et les petites solutions d’ARN interférant à fond dans un tube en pipetant de haut en bas pour atteindre un rapport azote/phosphate de 10. Placer le tube à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter ensuite un millilitre de tampon de phosphate de 10 millimlaires au pH huit au tube pour atteindre une concentration de 0,28 milligramme par millilitre et mélanger délicatement soit par pipetage ou en inversant le tube.
Pour confirmer que le pH final est neutre, autour de 7,2 à 7,5, pipette 10 microlitres de la petite solution interférante de nanoparticules d’ARN sur les bandes d’essai de pH. Tout d’abord, préparez un échantillon dynamique de diffusion de lumière en filtrant un millilitre de petites nanoparticules d’ARN interférant à la concentration de 0,28 milligramme par millilitre à travers des filtres à seringues de taille pore de 0,45 micromètre dans une cuvette carrée de quartz ou de polystyrène. Enregistrez ensuite les mesures de la taille et de la charge de surface à l’aide d’un instrument dynamique de diffusion de la lumière selon les spécifications du fabricant.
Pour confirmer la taille et la morphologie des petites nanoparticules interférantes d’ARN utilisant la microscopie électronique de transmission ajoutent d’abord cinq microlitres de petite solution de nanoparticule d’ARN interférant filtrée à 0,28 milligramme par millilitre à chaque grille de TEM. Placez les grilles à température ambiante pendant 60 secondes. Éponger à sec avec du papier filtre pendant trois secondes.
Ensuite, ajoutez cinq microlitres de solution d’acétate d’uranyl à chaque grille et incubez pendant 20 secondes. Éponger sec pendant trois secondes. Ensuite, placez les grilles dans un dessiccateur pour sécher toute la nuit avant l’imagerie sous microscopie électronique de transmission.
Pour effectuer le retardement de gel d’agarose, ajoutez d’abord deux grammes de poudre d’agarose de qualité électrophoresis à 100 millilitres de tampon 1X Tris-acétate-EDTA au pH huit dans un bécher pour produire 2% de gel d’agarose. Remuer pour suspendre l’agarose. Placer le bécher à découvert dans un four à micro-ondes pour chauffer pendant une à trois minutes jusqu’à ce que tout l’agarose soit dissous.
Une fois refroidi, ajouter cinq microlitres de bromure d’éthidium à la concentration de 10 milligrammes par millilitre dans le bécher et bien mélanger. Verser ensuite l’agarose dans un bac à gel et déposer le peigne pour produire des puits. Laisser sécher le gel pendant 30 minutes.
Retirez soigneusement le peigne pour laisser derrière vous les puits de chargement et versez le tampon 1X Tris-acétate-EDTA dans le bac à gel pour remplir jusqu’à la ligne de remplissage maximale. Placez ensuite deux aliquots microlitres de colorant de chargement sans SDS ou agents réducteurs sur le film de paraffine pour chaque petite formulation interférante de nanoparticules d’ARN à différents rapports d’azote à phosphate. Pipette pour mélanger 10 microlitres de petite solution interférante de nanoparticule d’ARN avec le colorant de chargement sur le film de paraffine.
Ajouter le mélange aux puits de gel agarose. Branchez le système d’électrophoresis à une source d’alimentation et de tension à 100 volts pendant 35 minutes ou jusqu’à ce que les échantillons aient traversé 80% de la longueur du gel. Transférez le gel du plateau à un transilluminateur UV et visualisez les petites bandes d’ARN interférantes sur le transilluminateur UV selon les spécifications du fabricant.
Déterminer le rapport azote/phosphate optimal en fonction de la disparition de petites bandes d’ARN interférantes au fond du gel. Pour abattre le gène modèle luciferase, les premières cellules exprimant la luciferase des graines dans une plaque à paroi noire de 96 puits avec DMEM en 10% FBS à une densité de 2000 cellules par puits. Placer la plaque dans un incubateur pendant la nuit pour permettre aux cellules d’adhérer.
Le matin, retirez les médias et ajoutez 10 microlitres par puits de petites nanoparticules d’ARN interférant diluées dans le plein sérum pour une dernière petite concentration d’ARN interférant de 100 nanomolaires. Retournez les puits à l’incubateur pendant 24 heures pour traiter les cellules avec de petites nanoparticules d’ARN interférantes. Le lendemain, remplacez les médias par des supports sériques complets contenant 150 microgrammes par millilitre de D-luciferin.
Incuber les cellules à température ambiante pendant cinq minutes avant de mesurer la luminescence sur un lecteur de plaque. Répétez ensuite le rafraîchissement médiatique deux fois avec des sérums frais et pleins sans D-luciferin, suivis de l’incubation pendant 24 heures. Remplacez le média par un sérum complet contenant 150 milligrammes par millilitre de D-luciferin et incubez à température ambiante pendant cinq minutes.
Mesurez la luminescence au point de temps de 48 heures. Pour les études longitudinales, laisser le couvercle sur le dessus de la plaque de puits lorsqu’il est à l’extérieur de l’armoire de biosécurité pour maintenir les cellules dans des conditions stériles et poursuivre l’incubation après avoir remplacé les médias contenant de la luciferine par des supports frais et pleins. Les mesures dynamiques de diffusion de la lumière montrent que la petite nanoparticule d’ARN interférante a un diamètre moyen de 35 nanomètres.
La présence d’un seul pic avec une largeur de pointe étroite indique une distribution nonimodale et une faible polydispersité. Les mesures de TEM confirment la mesure de taille de la diffusion dynamique de lumière suggère la présence d’une population uniforme de petites nanoparticules interférantes d’ARN et ont indiqué la morphologie sphérique des petites nanoparticules interférantes d’ARN. La concentration trop élevée de polymère dans l’étape de préparation a eu comme conséquence la petite nanoparticule interférante d’ARN deux dans le diamètre indésirable de plus de 200 nanomètres, une population multimodale et polydispersée, et des agrégats dans la solution formant aucune morphologie distincte de particule.
Les deux petites nanoparticules d’ARN interférantes une et deux affichent une charge de surface neutre indiquée par des valeurs potentielles moyennes de zeta proches de zéro. L’essai de retardement de gel d’Agarose montre la disparition des petites bandes interférantes d’ARN au fond de gel qui indique la complexité du petit ARN interférant au polymère. Polymère complexé petit ARN interférant est incapable de migrer à travers le gel et est donc visualisé au sommet du gel à proximité des puits de chargement.
Comme le rapport azote/phosphate est augmenté, la complexité de l’ARN interférant augmente, comme l’indique la diminution de l’intensité de la petite bande d’ARN interférant au fond du gel. La luciferase bioactive petite nanoparticule interférante d’ARN on montre l’activité significativement diminuée de luciferase par rapport au contrôle brouillé. En revanche, luciferase petite interférence ARN nanoparticule deux n’est pas considéré comme bioactif.
Pour produire des nanoparticules de siRNA cohérentes aux propriétés physicochimiques souhaitées, il faut utiliser des solutions polymères avec des concentrations appropriées et valider le pH des solutions tampons à chaque étape du protocole. En utilisant ces méthodes dans notre recherche, nous avons été en mesure de produire des thérapies à base de nanoparticules siRNA pour des gènes cancérigènes auparavant dédruggables et de tester l’efficacité de ces thérapies dans des modèles précliniques de cancer du sein.
