Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines des cellules souches et du cancer, comme l’hétérogénéité des cellules souches et la façon dont la thérapie dans les cellules cancéreuses sensibles peut être isolée. Le principal avantage de cette étude est qu’elle combine l’analyse techniquement robuste de l’expression des gènes unicell cellules avec la vaccinose pour une caractérisation plus poussée en aval des sous-populations cibles. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier le cancer et l’hétérogénéité des cellules souches, elle peut également donner un aperçu de l’amorçage génétique et du potentiel de lignée.
Pour commencer le protocole, sur un banc exempt d’ARN/ADN, préparer suffisamment de tampon de lyse pour 96 puits avec 10% de plus en mélangeant 390 microlitres d’eau sans nucléase, 17 microlitres de 10%NP-40, 2,8 microlitres 10 milli molaires dNTP, 10 microlitres 0,1 molaire DTT, et 5,3 microlitres inhibiteur RNAse. Vortex et tourner dans le tube. Ensuite, distribuez quatre microlitres de tampon de lyse à chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits et scellez les plaques avec du film adhésif.
Faites tourner les plaques pour recueillir le liquide au fond. Garder les plaques sur la glace jusqu’à ce que les cellules soient triées pendant un maximum de 24 heures. Une fois que la machine FACS a été correctement configurée, effectuez une réanalyse de la population cible en triant au moins 100 cellules cibles dans un nouveau tube de microcentrifugeuse avec 100 microlitres de tampon de tache.
Facs analyser les cellules triées en enregistrant l’échantillon trié et assurez-vous qu’ils se retrouvent dans la porte de tri. Ensuite, installez le tri des plaques unicell cellules en centralant la chute du puits A1 dans la plaque de 96 puits. Lorsqu’il est centré, trier 50 à 106 particules de micromètres dans tous les puits autour du bord d’une plaque vide de 96 puits pour s’assurer que tous les puits auront une cellule au centre de chaque puits.
Retirer le film adhésif des plaques. Trier une seule cellule de Lin-CD34 plus CD38 moins les cellules dans 92 des 96 puits. Activez le tri d’index dans le logiciel de tri FACS pour enregistrer le profil immunophéotypique pour CD45RA, CD49F et CD90 pour chaque cellule.
Trier deux puits avec respectivement 10 et 20 cellules pour les contrôles de linéarité dans l’amplification PCR. Les puits H1 et H2 sont généralement utilisés. Gardez deux puits sans cellules car aucun modèle ne contrôle, puits généralement H3 et H4. Sceller les plaques avec un film adhésif clair et faire tourner les plaques à 300 fois la gravité pendant une minute.
Casser le gel des plaques sur la glace sèche. Rangez-les ensuite à moins 80 degrés Celsius. Faites la transcription inverse et le mélange spécifique d’amplification cible en ajoutant 632,5 microlitres de mélange d’amorce de deux fois, 101,2 microlitres Taq/SuperscriptIII, 151,8 microlitres mélange d’amorce, et 0,7 microlitres piqués dans l’ARN de contrôle.
Vortex la solution et tournez-la vers le bas pour recueillir le liquide au fond du tube. Garder le mélange sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être ajouté à l’échantillon. Ensuite, décongelez les plaques de lysate sur la glace.
Ajoutez 8,75 microlitres de la transcription inversée précédemment préparée et du mélange d’amplification cible spécifique à 92 puits, y compris la linéarité et aucun contrôle de modèle. Ajouter 8,75 microlitres sans mélange de commande de transcription inversée aux quatre puits restants. Ensuite, sceller les plaques avec un film adhésif clair et faire tourner les plaques pour recueillir le liquide au fond.
Effectuez la transcription inverse et l’amplification cible spécifique en exécutant la plaque dans une machine PCR selon le programme préampli. Préparer la plaque de chargement d’essai en pipetant trois microlitres de réachemit de chargement d’essai à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter trois microlitres de chaque amorce aux puits individuels dans la plaque de chargement d’essai.
Sceller la plaque avec un film adhésif et la faire tourner vers le bas. Après avoir fait tourner la plaque, préparer la plaque de dilution en pipetant huit microlitres d’eau sans nucléase dans tous les puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter deux microlitres d’échantillon amplifié à la plaque de dilution.
Sceller la plaque avec un film adhésif. Mélanger en tourbillonnant la plaque pendant 10 secondes. Ensuite, tournez vers le bas de la plaque.
Ensuite, préparez le mélange de chargement de l’échantillon en mélangeant soigneusement 352 microlitres de mélange principal avec 35,2 microlitres de réaccent de chargement par échantillon. Préparer la plaque de chargement de l’échantillon en incitant 3,3 microlitres de mélange de chargement à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter 2,7 microlitres de l’échantillon dilué dans chaque puits de la plaque de chargement de l’échantillon.
Sceller la plaque avec un film adhésif et la faire tourner vers le bas. Sortez une nouvelle puce microfluidique 96 by 96. Préparez les entrées en les piquer avec une seringue avec un bouchon pour s’assurer qu’elles peuvent être déplacées.
Ajouter le volume total des seringues à chaque valve tout en inclinant la puce à 45 degrés et en appuyant sur la valve. Primez la puce avec le contrôleur IFC. Chargez chaque entrée d’analyse avec 4,25 microlitres de chacun des puits dans la plaque de chargement d’essai et évitez les bulles.
Si des bulles apparaissent dans le puits, retirez-les à l’aide d’une pointe de pipette. Continuez à charger chaque entrée d’échantillon avec 4,25 microlitres de chacun des puits de la plaque de chargement de l’échantillon, en évitant les bulles, et si des bulles semblent les enlever avec une pointe de pipette. Chargez la puce avec le contrôleur de circuit Fluidics intégré ou le contrôleur IFC.
Vérifiez que la puce semble même et que toutes les chambres ont été chargées. Retirez la poussière de la surface de la puce en la touchant avec du ruban adhésif. Enfin, exécutez la puce dans la plate-forme d’expression génétique microfluidique multiplexe.
Une carte thermique d’une course réussie affiche l’expression uniformément répartie à travers les échantillons avec un signal fort d’environ sept à 25 CTs. Cette courbe d’amplification de spiked dans l’ARN de commande vérifie que tous les puits ont l’expression claire d’environ 10 CT avec peu ou pas de variation, validant que la pré-amplification et les réactions de qPCR avaient été réussies pour toutes les cellules. L’analyse des composants principaux ou PCA qui visualise les similitudes entre les groupes cellulaires en utilisant la réduction des dimensions peut être utile pour distinguer les grappes de cellules moléculairement distinctes les unes des autres en identifiant ici quatre sous-groupes.
Pour identifier l’immunophénotype des cellules de différents groupes moléculaires, chargez le fichier FCS index dans FlowJo. Ouvrez l’éditeur de script et coller le script de l’index, appuyez sur Exécuter. Chaque cellule sera maintenant dans une porte séparée.
Ajoutez chaque cellule dans l’éditeur de mise en page et colorez-les en fonction du regroupement moléculairement défini de SCXV disponible dans le fichier sample_complete_data.xls. Les parcelles FACS montrent l’expression du marqueur de surface cellulaire pour les marqueurs hématopoïétiques de cellules souches CD90 et CD45RA qui peuvent être utilisés pour discriminer entre les grappes et les isoler pour une analyse fonctionnelle. À la suite de cette procédure, d’autres techniques comme le séquençage par ARN de sous-populations nouvellement découvertes ou d’expériences in vitro et in vivo peuvent être réalisées pour répondre à d’autres questions comme le mécanisme moléculaire qui cause cette hétérogénéité et comment la sous-population diffère-t-elle fonctionnellement.
Cette stratégie a ouvert la voie aux chercheurs non seulement pour étudier l’hétérogénéité dans l’hématopoïèse normale et maligne, mais peut également être utilisée pour isoler prospectivement les sous-populations découvertes pour les étudier davantage.
