Allumez le microscope confocal à balayage laser et placez la lame sur le support de lame. Pour la visualisation et l’acquisition d’images, sélectionnez l’objectif 20X. Dans le logiciel confocale, sélectionnez le mode de balayage séquentiel pour éviter la diaphonie entre le BODIPY 493/503 et le DAPI.
Ensuite, excitez la matrice BODIPY 493/503 à l’aide de la ligne laser argon de 488 nanomètres et la coloration DAPI à l’aide de la ligne laser de 405 nanomètres. Définissez les plages d’émission de 493 à 589 nanomètres pour BODIPY et de 410 à 464 nanomètres pour DAPI. Ensuite, configurez les paramètres du microscope en ajustant la taille des images, la vitesse de numérisation et la moyenne, qui inclut le nombre de deux fois la profondeur de bits comme 12 bits, la direction comme bidirectionnelle, le zoom numérique de la zone de balayage moins un et le trou d’épingle moins une unité de surface.
Ajustez les paramètres de gain et de gain numérique. Assurez-vous qu’il n’y a pas de pixels saturés comme indiqué par l’indicateur de portée. Après avoir identifié avec précision les gouttelettes lipidiques, acquérir l’image avec les canaux BODIPY et DAPI.
Pour créer des images étendues, passez à un objectif subjectif 10X. Activez ensuite le mode de numérisation des tuiles et configurez-le pour générer des images mosaïques cinq par cinq. Pour générer des vues 3D et orthogonales, appliquez une goutte d’huile d’immersion sur le dessus du verre de couverture et changez l’objectif pour un objectif 40X.
Sélectionnez le mode Z-stack. Ajustez le plan Z pour définir les première et dernière positions pour la capture d’image, garantissant une épaisseur de tranche optique d’environ 0,5 micron pour capturer toutes les gouttelettes mises au point. Sélectionnez le module ortho et créez des vues orthogonales.
Acquérir des images 3D en sélectionnant le module 3D en suivant le mode de rendu transparent. Après l’acquisition de l’image, commencez à traiter et à analyser les images à plan unique à l’aide de CellProfiler. Téléchargez les images au format TIF en cliquant sur le mode images dans le coin supérieur gauche de l’interface CellProfiler.
Utilisez le module Noms et types pour trier entre les images colorées par gouttelettes BODIPY et noyaux DAPI en fonction des noms de fichiers. Pour l’analyse des gouttelettes lipidiques, utilisez uniquement des images colorées BODIPY. Lancez la construction du pipeline en cliquant sur ajuster les modules et sélectionnez le module couleur en gris pour convertir les images en niveaux de gris.
Ensuite, à l’aide du module d’identification des objets primaires, définissez des gouttelettes lipidiques comprises entre 6 et 300 pixels et un facteur de correction de seuil de un pour détecter les gouttelettes lipidiques dans les images en niveaux de gris. Pour mesurer l’intensité en pixels des gouttelettes lipidiques identifiées, ajoutez un module de mesure de l’intensité de l’objet. Incorporer un module d’objets filtrants supplémentaire pour s’assurer que seuls les signaux les plus forts sont quantifiés tandis que les signaux moins intenses sont exclus de l’analyse finale des gouttelettes lipidiques.
Ensuite, pour mesurer les gouttelettes lipidiques liées aux données de sortie, ajoutez le module de forme de taille d’objet de mesure. Ajoutez ensuite un module de contours de superposition pour superposer la gouttelette identifiée sur l’image originale et ainsi vous assurer que la segmentation semble précise sur l’image non traitée. Une fois cela fait, ajoutez une exportation au module de feuille de calcul et cliquez sur le bouton analyser les images dans le coin inférieur gauche.
Par rapport au groupe témoin, les animaux nourris à HFD présentaient un profil dyslipidémique prononcé et une augmentation subtile des taux de triglycérides circulants. Les images étendues ont révélé une augmentation des gouttelettes lipidiques dans le foie des animaux nourris au HFD. L’analyse avec CellProfiler a révélé une augmentation du nombre de gouttelettes lipidiques hépatiques, une augmentation de l’intensité de fluorescence BODIPY, un rapport de surface de 360% et des diamètres plus importants.
La distribution granulométrique chez les animaux nourris à HFD a révélé une augmentation des gouttelettes lipidiques hépatiques macro-vésiculaires de plus de neuf microns et une réduction des microvésicules de moins de trois microns.
