Pour commencer, dans une plaque à six puits, ensemencez un millilitre de cellules 293T de rein embryonnaire humain. Ajoutez deux millilitres de DMEM complet. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu frais sans antibiotiques pour préparer les cellules à la transfection.
Pour transfecter les cellules adhérentes, préparez d’abord le mélange A en ajoutant de l’ADN plasmidique à 100 microlitres d’Opti-MEM. Ensuite, ajoutez 17,5 microlitres de polyéthylénimine à 100 microlitres d’Opti-MEM. Mélangez le contenu du mélange A et B, puis incubez.
Pendant l’incubation, effleurez doucement le tube toutes les trois à quatre minutes pour améliorer le mélange. Ajouter tout le volume du mélange dans l’assiette avec les cellules HEK 293T. Après 16 à 20 heures de transfection, remplacer le milieu de culture par du DMEM complet frais.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pour produire les virus pseudo-types. Après 72 heures de transfection, récoltez le surnageant dans un tube de prélèvement. Centrifuger le surnageant à 1 600 G pendant sept minutes à température ambiante.
Filtrez ensuite le surnageant à travers un filtre en acétate de cellulose de 0,45 micromètre. Distribuer 50 microlitres de DMEM complet dans les puits d’une plaque de 96 puits. Laissez la ligne A vide.
Ajouter 100 microlitres de la souche de pseudovirus dans les puits de la rangée A.Ensuite, pipeter 50 microlitres de la solution de la rangée A à la rangée B.Répéter ce processus jusqu’à la rangée G pour obtenir des dilutions en série. Retirez le milieu épuisé d’une plaque contenant des cellules HEK 293T ACE2 sensibles en culture et lavez les cellules avec quatre millilitres de DPBS. Ensuite, détachez les cellules avec un millilitre de trypsine EDTA dans une solution saline DPBS.
Ajoutez maintenant 50 microlitres de la suspension cellulaire sensible dans chaque puits contenant les virus de pseudotype. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Ajouter 100 microlitres de réactif luciférase dans chaque puits.
Après l’incubation, transvaser le contenu de chaque puits dans une plaque noire à 96 puits. Lisez ensuite la plaque dans un lecteur de plaques. Dans une plaque à 96 puits, ajouter 50 microlitres de DMEM complet frais dans les colonnes 1 à 10 des rangées B à H.Ajouter 95 microlitres de DMEM complet frais dans les puits correspondants de la rangée A.Ajoutez maintenant 50 microlitres de DMEM complet dans les puits de la colonne 11 et 100 microlitres de DMEM dans la colonne 12.
Pipeter cinq microlitres d’échantillons de sérum inactivé par la chaleur dans la rangée A.À l’aide d’une pipette multicanaux, mélanger les échantillons de la première rangée et transférer 50 microlitres de sérum contenant un milieu de la rangée A à la rangée B jusqu’à la rangée H.Distribuer 50 microlitres de milieu contenant un pseudovirus dilué dans chaque puits, de la colonne un à la colonne 11. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Préparez une suspension de cellules sensibles HEK293T ACE2 dans cinq millilitres.
Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits, puis incubez avant d’effectuer le dosage de la luciférase. Une dilution sérique plus faible a entraîné une diminution de l’entrée virale dans les cellules. Ceci est confirmé par l’augmentation du pourcentage de neutralisation.
