Ce travail a été financé par le Wellcome Trust WT091939MA subvention. Alain Filloux est soutenue par la Royal Society.

1. Souches bactériennes et les cultures <ol><li> Ingénieur une cellule d&#39;Escherichia coli destinataire (Prey, P) par la transformation (en utilisant la norme de CaCl2 traitement ou électroporation) 15 E. coli DH5a cellules avec un plasmide permettant la complémentation d&#39;une-du gène lacZ (tableau 1). Plaque les cellules transformées sur des plaques d&#39;agar Luria-Bertani (LBA, l&#39;agar 1,5%) contenant du 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) à 40 mg / ml de concentration finale et un antibiotique approprié. Incuber à 37 ° C pendant la nuit et le lendemain matin sélectionner les transformants bleu (voir § 1.3). </li><li> Cultiver les cellules de Pseudomonas aeruginosa donateurs qui sont T6SS-actif (D +) ou T6SS-inactive (D-) (tableau 1) toute la nuit LBA à 37 ° C. Dans l&#39;exemple présenté ici, nous avons utilisé un P. TER aeruginosa souche possédantun H1-T6SS constitutivement active 16 et un mutant isogénique avec une délétion du gène H1-grappe T6SS (tableau 1). </li><li> Le lendemain, préparer une culture de nuit de liquide dans un flacon aéré par inoculation d&#39;un clone bleu vif parmi les E. transformants coli (P) de la plaque décrite au § 1.1, dans 5 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) additionné de l&#39;antibiotique approprié. Croître sous agitation à 37 ° C. Procéder également avec une seule colonie de (D +) et de (D -) de la plaque décrite au § 1.2. </li></ol> 2. Test de compétition <ol><li> Préparer les plaques LBA pour l&#39;expérience lendemain. Assurez-vous que ces plaques sont correctement séché (soit près du brûleur Bunsen ou hotte à flux laminaire). Préparez un &quot;test d&#39;entrée&quot; (A-Entrée) plaque pour les souches (D +), (D -) et (P </strong&gt;). Préparez un &quot;test-output&quot; (A-sortie) pour les souches plaque (D - + P) et (D + + P). Diviser pour marquer les plaques en conséquence. </li><li> Après une croissance de nuit (voir § 1.3), mesurer la densité optique (DO 600 nm) de la culture bactérienne d&#39;entrée (D - D + et P) et calculer le volume nécessaire pour obtenir une densité cellulaire équivalent à 1 unité de DO 600 nm de chaque souche . Chaque culture &quot;input&quot; cellule (D - D + et P) est d&#39;abord recueillie dans un 1.5 stériles tubes Eppendorf ml. </li><li> Centrifuger les échantillons bactériens à 13.000 rpm pendant 1 min à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les culots de la D -, D + cultures, et P, dans 100 ul de frais TSB par pipetage doux et inoculer 10 ml de chaque cordant souche comme un seul point sur la &quot;A-entrée&quot; plaque (préparé au § 2.1). </li><li> Inoculer le &quot;A-sortie&quot; plaque (préparé au § 2.1). Plus précisément, mélanger doucement 30 ul de (D +) avec 30 pi (P) et 30 ul de (D -) avec 30 ml (P) dans deux tubes Eppendorf distinctes (notez que les cultures utilisées sont celles décrites au § 2.4) . Inoculer 20 ul du mélange (D + / P) et (D - / P) sous forme de points individuels sur la &quot;A-sortie&quot; plaque. Laisser sécher les gouttes à proximité d&#39;un bec Bunsen et placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant une période de temps appropriée au cours de laquelle l&#39;effet bactéricide est en cours. Dans le cas de P. aeruginosa, une mise à mort efficaces bactérienne n&#39;est observée après 5 heures d&#39;incubation lorsque l&#39;on compare un T6SS actifs avec une souche T6SS défectueux. </li></ol> 3. Observation qualitative de til bactéricide <ol><li> Préparer les plaques LBA contenant 40 ug / ml de X-gal pour la lecture de l&#39;essai. Les plaques seront appelés &quot;entrée Lecture&quot; ou &quot;entrée R&quot; pour repérer les bactéries isolées ou les &quot;Lecture&quot; ou &quot;R-sortie&quot; pour repérer cultures mixtes de bactéries et donc lu la performance tuer. Ces plaques doivent également être séché. Diviser la plaque en quatre parties égales sur son dos et annoter ces pièces 0, 10 -1, 10 -2 et 10 -3, désignant les dilutions de culture bactérienne à repérer sur les plaques d&#39;agar (voir § 3.3). La dilution permet une évaluation semi-quantitative du rapport bleu / blanc bactéries dans le même endroit. </li><li> Ramasser à l&#39;aide d&#39;une anse stérile les taches individuelles bactériennes de l&#39;&quot;Une entrée&quot; plaque (voir § 2.4) et &quot;A-sortie&quot; plaque (voir § 2.5) et remettre chaque point dans différents tubes Eppendorf de 1,5 ml contenant 1 ml de TSB. Placez-les dans un bloc agitateur Eppendorf pendant 30 min pour remettre efficacement l&#39;bactéries. </li><li> Préparer une série de 5 fois des tubes Eppendorf 3 contenant 900 ul de TSB et procéder pour chaque tache remis en suspension à dix dilutions allant jusqu&#39;à 10 -3. Assurez-vous de changer les embouts de pipette et de vortex 5 secondes entre chaque étape de dilution. </li><li> Passez à l&#39;repérage de vos dilutions bactériennes préparées au § 3.3 sur les plaques LBA bien séchées contenant 40 ug / ml de X-gal, en commençant par la plus diluée à la suspension non diluée, ce qui rend ces les &quot;R-&quot; plaques d&#39;entrée pour le &quot;A d&#39;intrants et les &quot;points&quot; R-sortie &quot;pour les plaques&quot; A-&quot;points de sortie (figure 2). Vortex brièvement chaque tube avant de procéder à la repérer à maintenir une suspension homogène bactérienne. Pour la reproductibilité des résultats, spot de 20 pi en trois exemplaires au sein d&#39;un quart de cercle (figure 2). La sécheresse relative de votre assiette est important à ce stade car les points doivent rester séparés individuellement sur la plaque et ne glissera pas vers l&#39;autre. Une quantification de l&#39;essai de compétition est également possible à ce stade de l&#39;expérimentation. Après l&#39;étape 3.3, épandage 100 ul de dilution des 10 -3 sur des plaques LBA contenant 40 ug / ml de X-gal. Pour la reproductibilité des résultats, procéder à un placage en trois exemplaires pour chaque point de la &quot;A-sortie&quot; plaque. Placez les plaques de dilution dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit (ce qui correspond à 16 heures d&#39;incubation). Procéder au comptage des colonies bleues (les cellules qui sont restés en vie P). Des résultats typiques obtenus après 5 heures de compétition sont présentés dans la figure 3. </li><li> Laisser la plaque (sans couvercle) ouverte dans une zone stérile pour permettre l&#39;absorption du liquide en excès à l&#39;intérieur de chaque tache. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Pendant ce temps d&#39;incubation, la mort est toujours en cours dans le mélange (D + / P) puisque les deux souches sont toujours en contact. </li><li> Prendre une photoou numériser vos assiettes pour l&#39;analyse de sortie (Figure 2). Où points restent en grande partie bleue indique que E. coli n&#39;a pas été tué par P. aeruginosa. C&#39;est le cas lorsque E. coli est mélangé avec un p-T6SS défectueuse aeruginosa souche (D-) (figure 2, la plaque en bas à droite). </li></ol>

<ol>
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Nous n&#39;avons rien à déclarer.

La méthode présentée dans cet article permet une observation visuelle de T6SS activité médiée / bactériostatique bactéricide. Le dosage est réalisé sur la surface d&#39;une plaque de gélose. Il a été précédemment montré que le dosage en fonction de meurtre T6SS réalisée avec liquide de culture bactérienne mixte n&#39;est pas efficace, probablement en raison de l&#39;absence d&#39;un contact permanent entre les deux bactéries 8. Le T6SS est censé fonctionner avec un mécanisme semblable à celui utilisé par les bactériophages pour injecter l&#39;ADN dans des 17 cellules cibles. En culture liquide, la structure en forme de tube de l&#39;T6SS peut se casser plus facilement, entre-bactérien de contact peuvent être perdus, et les toxines ne sont pas fournis efficacement. En termes de temps d&#39;incubation, les 5 premières heures de contact que nous décrivons entre la souche donneuse et la proie sont suffisantes pour observer la bactéricidie entre P. aeruginosa et E. coli, comme illustré dans la figure 3 </strong&gt;. Néanmoins, il est conseillé de régler le temps d&#39;incubation en effectuant une cinétique afin d&#39;optimiser les conditions expérimentales. Étant donné que cette méthode est une technique basée sur la couleur, les résultats de sortie peut être compromise par la pigmentation de la souche donneuse. Par exemple, dans le cas de P. aeruginosa, certaines souches produisent des niveaux élevés de pigments colorés tels que pyocyanine et pyoverdine, qui peuvent interférer avec la lecture d&#39;essai, ce qui rend la distinction de la proie relativement difficile. D&#39;autres chromogènes β-galactosidase substrats, tels que le magenta ou le gal gal rouge, peut être utilisé à la place du X-gal (tableau 1). Le test de compétition peut faire usage de gènes rapporteurs autres pour la lecture. Par exemple, le dosage similaire a également été réalisée en utilisant la protéine fluorescente verte marquée proies 12. Notre analyse, tout en n&#39;étant pas quantitative, donne une bonne indicationde l&#39;activité T6SS car elle est basée sur la survie ou la mort d&#39;un journaliste proie. Cette technique présente l&#39;avantage d&#39;être simple et pratique pour évaluer l&#39;activité bactéricide / bactériostatique de T6SSs de toutes les espèces bactériennes. Jusqu&#39;à présent, l&#39;activité de la T6SS a été démontré contre les bactéries Gram-négatives et aucun exemple clair de T6SS sensibles à bactéries Gram-positives a été signalé à ce jour 12. Il est également évident que l&#39;incompatibilité de la culture des différentes espèces bactériennes à tester (par exemple, la croissance de la température, l&#39;oxygénation, les médias spécifiques) doit être pris en considération. Notre test peut également être utilisé pour évaluer laquelle des composants T6SS sont absolument indispensables puisque même les traces d&#39;une toxine sécrétée pourrait être suffisante pour tuer la proie. Même une faible activité des T6SS pourrait alors être clairement détectée par notre analyse par rapport à la procédure standard de test T6SS-dépendante la sécrétion de l&#39;aide blot du surnageant de culture et de l&#39;Ouestanalyse. Cependant, une bonne unité formant colonie (UFC) de comptage est toujours nécessaire pour la quantification précise de cette activité T6SS.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ TER (D +) (T6SS actifs) </td><td> Souche de laboratoire </td><td></td><td> Décrit dans Référence 16 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ TER Δ S1-T6SS (D -) (T6SS inactifs) </td><td> Cette étude </td><td></td><td> Le groupe H1-T6SS (englobant les gènes PA0070 PA0095 à) a été supprimé par échange allélique suivant la procédure décrite dans la référence 18. Le fragment mutateur a été généré avec l&#39;ensemble d&#39;amorces suivant: Les amorces fragment Up: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, et 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. Les amorces de fragments Down: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E. coli DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 A1 fin hsd R17 (r k -, m k +) pho Un soutien E44 λ-thi -1 gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Ce vecteur exprime le peptide β α-galactosidase d&#39;utiliser pour α-complémentation. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> Utilisez à 40 pg / ml </td></tr><tr><td> Luria Bertani agar </td><td> Merck-chimiques </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (caséine de soja bouillon) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex Agitateur Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 Densimètre portable </td><td></td></tr><tr><td> Magenta-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Red-gal </td><td> Organiques recherche </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Souches, plasmide, la matière et le réactif utilisé. </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

Systèmes de sécrétion de type VI (T6SSs) sont des nanomachines moléculaires permettant bactéries Gram-négatives à transporter et injecter des protéines dans une grande variété de cellules cibles 1,2. Le T6SS est composé de 13 éléments de base et présente des similitudes structurelles avec la queue de bactériophages tube 3. Le phage utilise un tube et un dispositif de perforation pour percer l&#39;enveloppe cellulaire des bactéries cibles et injecter l&#39;ADN. Il est proposé que le T6SS est un dispositif bactériophage inversé la création d&#39;un chemin spécifique dans l&#39;enveloppe cellulaire bactérienne à conduire des effecteurs et de toxines à la surface. Le processus pourrait être plus poussée et l&#39;appareil pourrait perforer T6SS autres cellules de la bactérie qui est en contact, donc l&#39;injection des effecteurs dans ces objectifs. Le tube de queue et des parties de dispositif de perforation de la T6SS sont réalisés avec les protéines et Hcp VgrG, respectivement 4,5. La polyvalence de la T6SS a été démontrée par ses études utilisant diverses bactéries pathogènes. Les T6SS Vibrio cholerae peuvent remodeler le cytosquelette des cellules hôtes eucaryotes par injection d&#39;un «évolué» VgrG portant un actine C-terminale de réticulation de domaine 6,7. Un autre exemple frappant a été récemment documentés à l&#39;aide de Pseudomonas aeruginosa qui est capable de cibler et de tuer les bactéries d&#39;une manière T6SS-dépendante, favorisant ainsi la création de bactéries dans des niches microbiennes spécifiques et l&#39;environnement concurrentiel 8,9,10. Dans ce dernier cas, trois T6SS-protéines sécrétées, à savoir Tse1, TSE2 et tse3 ont été identifiés comme les toxines injectées dans les bactéries cibles (figure 1). La cellule donneuse est protégé contre les effets délétères de ces effecteurs par l&#39;intermédiaire d&#39;un mécanisme anti-toxine, médiée par les protéines de l&#39;immunité TSI1, Tsi2 et Tsi3 8,9,10. Cette activité antimicrobienne peut être surveillée en cas T6SS-compétents bactéries sont co-cultivés sur sOlid surfaces en concurrence avec d&#39;autres espèces bactériennes ou avec T6SS-inactifs les bactéries de la même espèce 8,11,12,13. Les données disponibles accent sur une approche numérique pour le test de compétition bactérienne, y compris le comptage CFU temps que dépend en grande partie responsables des antibiotiques. Dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques comme P. aeruginosa, ces méthodes peuvent être inappropriés. En outre, avec l&#39;identification d&#39;environ 200 différents loci T6SS dans plus de 100 génomes bactériens 14, un outil de dépistage pratique est hautement souhaitable. Nous avons développé un test qui est facile à utiliser et nécessite du matériel de laboratoire standard et de réactifs. La méthode propose une technique rapide et qualitative de surveiller l&#39;activité bactéricide dépendant T6SS / bactériostase en utilisant une souche journaliste comme une proie (dans ce cas, Escherichia coli DH5a) permettant une complémentation &#39;du gène lacZ. Dans l&#39;ensemble, cette méthode est graphic et permet l&#39;identification rapide des phénotypes liés T6SS sur des plaques d&#39;agar. Ce protocole expérimental peut être adapté à d&#39;autres souches ou espèces bactériennes en tenant compte des conditions spécifiques, tels que les milieux de croissance, de la température ou du temps de contact.

Des résultats typiques sont présentés dans la figure 1, les souches et les réactifs décrits dans le tableau 1. Les plaques représentées dans cette figure ont été scannés après une nuit d&#39;incubation. Les «Lecture-Input&quot; plaques montrent un modèle de dilution en série pour les souches utilisées dans cet essai. Comme prévu, le E. coli proie points (P) surexprimant le gène lacZ apparaissent en bleu sur des milieux supplémentés avec X-gal, tandis que le P. donateurs aeruginosa (D +, T6SS actif) et (D -, inactif T6SS) restent blancs. Les «Lecture-sortie&quot; plaques sur lesquelles le mélange entre la proie et une souche T6SS actif (D + / P) a été repéré montrent la disparition du bleu proie indiquant ainsi qu&#39;il a été tué. Ceci démontre la capacité du donneur à supplanter la proie. La persistance de la couleur bleue sur le (D - / P) Plaque démontre l&#39;incapacité d&#39;un donneur T6SS inactif pour tuer la proie bleu. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Meurtre de E. coli par T6SS compétents dans P. aeruginosa. P. aeruginosa injecte des toxines dans l&#39;E. cellule cible coli d&#39;une manière T6SS-dépendant (indiqué par la flèche blanche). Deux toxines et Tse1 tse3 (orange et rouge cercles) sont injectés dans le E. périplasme coli et de dégrader le peptidoglycane 9. La toxine TSE2 (cercle jaune) est injecté dans le E. coli cytoplasme et possède une action bactériostatique 8,10. L&#39;action combinée des toxines tue les cellules cibles (l&#39;éclair et le crâne). La survie des cellules cibles peuvent être détectées en surveillant l&#39;activité de la β-galactosidase produite (voir aussi la figure 2). P. uneruginosa est protégé contre l&#39;activité des toxines par les protéines de l&#39;immunité TSI1, Tsi2 et Tsi3 (orange, carrés jaunes et rouges, respectivement) 8,9,10. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Figure 2. Essai sur plaque de gélose pour surveiller T6SS dépendant de la bactéricidie Dans cette figure sont représentés sur la partie supérieure des «Lecture-Input&quot; plaques comprenant des dilutions en série du D -., D + et les cellules d&#39;entrée P. Les cellules d&#39;entrée P sont bleues en raison de l&#39;α-complémentation du gène lacZ et donc à des β-galactosidase qui clive X-gal. Dans la partie inférieure est montré les «Lecture-sorties&quot; plaques constituées de dilutions successives du mélange bactérienne entre un actif (D + / P) </strong&gt;, ou un inactif (D - / P), T6SS donneur P. souche E. aeruginosa avec l&#39; coli proie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Quantification de l&#39;assassinat de E. coli par P. aeruginosa après 5 heures d&#39;incubation. Le graphique présente le comptage CFU de E. coli décrite dans l&#39;étape de 3,4. Les résultats présentés ici montrent une différence de 3 fois entre le T6SS + et les T6SS-souches, ce qui suggère que la plupart des meurtres se déroule pendant les 5 premières heures de contact.

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Nous décrivons un test qualitatif de surveiller la concurrence bactérienne médiée par le<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emType&gt; sécrétion système VI (T6SS). Le test repose sur la survie / destruction des cellules d&#39;Escherichia coli cibles portant un<em&gt; LacZ</em&gt;-Reporter. Cette technique est réglable afin d&#39;évaluer l&#39;activité bactéricide / bactériostatique de T6SS-compétents micro-organismes.

Un test visuel pour surveiller T6SS à médiation bactérienne concurrence

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K vues.  Imperial College London. Nous décrivons un test qualitatif de surveiller la concurrence bactérienne médiée par le Pseudomonas aeruginosa sécrétion système VI (T6SS). Le test repose sur la survie / destruction des cellules d'Escherichia coli cibles portant un LacZ-Reporter. Cette technique est réglable afin d'évaluer l'activité bactéricide / bactériostatique de T6SS-compétents micro-organismes.

Vidéo: A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Recherche

Immunologie et infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilisation de l&#39;Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Évaluation visuelle et microscopique de Streptomyces Mutants du développement

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...