Ce travail a été soutenu par le fonds de recherche interne de l’Université George Mason.

1. Assemblage de virus et de particules virales
<ol><li>Vecteurs : Achetez commercialement des vecteurs d’expression pour le SARS-CoV-2 M, E ou N ainsi que pour le SARS-CoV-2 S (type sauvage, Wt), Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529). NOTA : Les séquences protéiques des vecteurs d’expression sont fournies dans le fichier supplémentaire 1. Le fournisseur de ces vecteurs d’expression peut également être trouvé sous la table des matériaux.</li>
	<li>Cellules et culture cellulaire : Conserver HEK293T cellules dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 50 unités/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine. REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité à flux d’air laminaire. La transfection de la polyéthylèneimine (PEI) nécessite généralement 5 à 6 heures d’incubation. Les heures de début doivent être soigneusement réfléchies au préalable.</li>
	<li>Assemblage de virus et cotransfection basée sur l’IPE : Assembler des particules de Ha-CoV-2 par cotransfection de HEK293T cellules. Semez les cellules dans une boîte de Pétri de culture cellulaire de 10 cm (4-5 x 10,6 cellules par boîte) dans 10 mL de milieu DMEM complet la veille de la cotransfection. Pour cette étude, trois boîtes de Pétri sont utilisées pour ensemencer les cellules pour l’assemblage de Ha-CoV-2 de type sauvage, Delta et Omicron, respectivement.</li>
	<li>Incuber des boîtes de Pétri pendant une nuit dans un incubateur deCO2 à 37 °C. Vérifiez les plats le lendemain matin pour vous assurer que les cellules sont confluentes à 80 %. Retirer le milieu complet et le remplacer par 9 ml de milieu sans sérum DMEM.</li>
	<li>Pour chaque plat, préparer un mélange de cotransfection avec 2,5 μg de chacun des vecteurs d’expression des protéines structurelles du SRAS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg de pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (génome HaCoV2) et 2,5 μg du vecteur d’expression de la protéine S, soit les variants Delta ou Omicron S, et 45 μL de réactif de transfection à base d’IPE. Laisser le mélange de cotransfection former des complexes en incubant pendant 13 min (ne pas incuber plus de 30 min).</li>
	<li>Après l’incubation, ajoutez lentement le mélange de cotransfection dans chaque boîte de Pétri, goutte à goutte. Placez les plats dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant 6 h. Après 6 h, retirez le DMEM sans sérum et remplacez-le par un milieu DMEM complet. Récoltez le virus 48-60 h après la cotransfection.</li>
	<li>Récolte et entreposage des virus : Récolter les particules 48 h après la cotransfection. Détacher les cellules en les pipetant à plusieurs reprises sur la surface de la monocouche et prélever les cellules de chaque boîte, les placer dans des tubes à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. Prélever le surnageant et le faire passer à travers un filtre de 0,22 μM. Conservez le pseudovirus Ha-CoV-2 à -80 °C.</li>
</ol>2. Essai d’infectiosité virale
<ol><li>Cellules et culture cellulaire : Conserver les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 50 unités/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine.</li>
	<li>Ensemencement de cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : La veille du test d’infectiosité virale, ensemencer des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans une plaque de 96 puits dans 50 μL de milieu DMEM complet. Pour chaque plaque de 96 puits, ensemencer 2,5 x 104 cellules dans chaque puits, et un total de 2,5 x 106 cellules sont nécessaires pour une plaque. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Infection de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : Utilisez des particules variantes du Ha-CoV-2 pour infecter les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Le matin de l’infection, prélever 50 μL de DMEM de la plaque pré-ensemencée à 96 puits. Remplacer le milieu par 50 μL de Ha-CoV-2 de type sauvage, Delta ou Omicron pendant 18 h à 37 °C. REMARQUE : Le protocole peut être arrêté ici jusqu’à ce que l’infection ait atteint 18 h d’incubation et que la plaque soit prête à être analysée par dosage de la luciférase. Le succès de l’infection est déterminé par le test de la luciférase résultant du gène rapporteur de la luciférase exprimé dans les cellules infectées, donc plus le signal est produit, plus l’infection du variant Ha-CoV-2 est réussie.</li>
	<li>Dosage de la luciférase : Après 18 h d’incubation, ajouter 7,5 μL de tampon de lyse cellulaire directement dans chaque puits et mélanger par agitation orbitale pendant 2 min. Lyser les cellules dans un tampon de lyse pendant au moins 5 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Préparez la solution de test de luciférase Firefly en mélangeant la solution de D-luciférine avec la solution de test de luciférase Firefly dans un rapport de 1 :50. Pour une plaque entière à 96 puits, combiner 3 mL de solution de substrat de luciférase avec 60 μL de solution de D-luciférine avec 2940 μL de solution tampon de luciférase Firefly.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de la solution de test de luciférase Firefly aux lysats cellulaires et mélanger la plaque en agitant orbitalement pendant 1 min. Analysez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques de luciférase commercial.</li>
</ol>3. Extraction de l’ARN de Ha-CoV-2 et PCR quantitative par transcriptase inverse (RT-qPCR)
<ol><li>Extraction de l’ARN viral : Extraire l’ARN viral des particules de type sauvage Ha-CoV-2 et des variants Delta et Omicron du Ha-CoV-2 à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN viral commercial, en suivant les instructions du fabricant. Conservez l’ARN viral extrait à -80 °C ou utilisez-le immédiatement pour la RT-qPCR.</li>
	<li>RT-qPCR : Effectuez une RT-qPCR sur l’ARN viral à l’aide d’un master mix en une étape. Effectuez la réaction dans un appareil PCR commercial. Veuillez noter que la cible de l’amplification est l’ARN génomique de Ha-CoV-2. Utilisez l’ADN du vecteur Ha-CoV-2 comme norme pour créer une courbe standard et calculer le nombre de copies d’ARN de chaque variant.</li>
</ol>4. Test d’anticorps neutralisants
<ol><li>Ensemencement de cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) : La veille de l’essai, ensemencer des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) dans une plaque de 96 puits dans 50 μL de milieu DMEM complet. HEK293T(ACE2/TMPRSS2) sont achetés dans le commerce.</li>
	<li>Pour le comptage des cellules, obtenir 20 μL de cellules d’une fiole T75 contenant des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) et mélanger avec 20 μL de solution de bleu trypan. Ajouter 20 μL de ce mélange dans la chambre de comptage des cellules et compter le nombre de cellules par ml. Pour ensemencer une plaque de 96 puits pour l’infection, utilisez 2,5 x 104 cellules par puits, et 2,5 x 106 cellules seront nécessaires au total. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Test d’anticorps neutralisants : Dans une plaque stérile en polypropylène à 96 puits, préparer le mélange standard d’anticorps neutralisants 27BV et de Ha-CoV-2. Ajouter 8 μL de 27BV (45 mg/mL) dans la plaque et effectuer des dilutions en série de l’anticorps avec 6 μL de DMEM sans sérum. REMARQUE : Assurez-vous d’échanger les pointes de pipette entre les transferts de puits et assurez-vous que l’anticorps et le milieu sans sérum sont bien mélangés pour produire des résultats précis.</li>
	<li>À l’anticorps dilué en série, ajoutez 54 μL de particules Ha-CoV-2 et mélangez le virus et l’anticorps. Pré-incuber des particules de Ha-CoV-2 avec du 27BV dilué en série pendant 1 h à 37 °C à 5 % de CO2. Après 1 h d’incubation, appliquer 50 μL du mélange d’anticorps et de Ha-CoV-2 sur la plaque de 96 puits contenant les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 104 cellules par puits) ensemencées la veille.</li>
	<li>Pour les témoins, laissez au moins trois puits contenant uniquement les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Ajouter 50 μL de milieu complet à ces puits pour servir de puits non infectés pour le signal de fond des lectures de l’essai de luciférase. NOTE : Le protocole peut être arrêté ici jusqu’à ce que l’infection ait atteint 18 h d’incubation à 37 °C, puis la plaque est prête à être analysée par dosage de luciférase.</li>
	<li>Dosage de la luciférase : Après 18 h d’incubation, ajouter 7,5 μL de tampon de lyse directement dans chaque puits et mélanger en agitant orbitalement pendant 2 min. Lyser les cellules dans un tampon de lyse pendant au moins 5 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Préparez la solution de test de luciférase Firefly en mélangeant la solution de D-luciférine avec la solution de test de luciférase Firefly dans un rapport de 1 :50. Pour une plaque entière de 96 puits, combiner 3 mL de la solution de substrat de luciférase avec 60 μL de solution de D-luciférine avec 2940 μL de solution tampon de luciférase de luciférase.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de la solution de test de luciférase Firefly aux lysats cellulaires et mélanger la plaque en agitant orbitalement pendant 1 min. Analysez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques de luciférase commercial.</li>
</ol>5. Quantification et analyse statistique
<ol><li>Collecte des données : Effectuer des tests d’infection et de luciférase en trois exemplaires comme indiqué (Figure 1). Quantifiez l’expression de la luciférase avec les lectures du test de luciférase. La moyenne est la valeur moyenne des trois lectures du test de luciférase. Les lectures du signal de fond des puits non infectés sont soustraites de cette valeur moyenne. L’écart-type (ET) est déterminé à partir de la valeur moyenne des lectures du test de luciférase.</li>
	<li>Analyse des données : Tracez l’activité de neutralisation des anticorps et calculez les valeurs ID50 (dose d’inhibition de 50 %) à l’aide d’un logiciel graphique commercial. La valeur ID50 est définie comme les dilutions inhibitrices d’anticorps auxquelles une réduction de 50 % de l’infection des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (sur la base des lectures du test de luciférase) est atteinte.</li>
</ol>

Quantification des anticorps neutralisants induits par le vaccin dans les variants du SRAS-CoV-2

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+novel+SARS-CoV-2+Omicron+(B.1.1.529)+variant+of+concern+and+its+global+perspective.">Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective.</a> Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).</li></ol>

Un brevet a été déposé par l’Université George Mason et concédé sous licence à Virongy Biosciences Inc. pour le développement de produits. Y.W. est fondateur et membre du conseil consultatif de Virongy Biosciences. B. H est actuellement PDG et directeur scientifique de Virongy Biosciences. Les auteurs n’ont pas d’autres conflits d’intérêts.

La plateforme Ha-CoV-2 fournit un flux de travail rapide, robuste et simple pour quantifier les variants viraux et neutraliser les anticorps. Cependant, il y a quelques étapes critiques qui nécessitent une attention particulière. La production du pseudovirus Ha-CoV-2 doit être réalisée à l’aide de cellules HEK293T à haute viabilité. L’efficacité de la cotransfection peut être surveillée 24 heures après la transfection à l’aide du gène rapporteur GFP du génome Ha-CoV-2. Le génome du Ha-CoV-2 peut contenir deux rapporteurs (GFP et Luc), et la GFP peut être exprimée pendant la cotransfection et après l’infection par le Ha-CoV-2 des cellules cibles12. Les cellules GFP+ de l’infection sont normalement à un faible pourcentage (1 % à 5 %), mais chaque cellule infectée exprime de forts signaux GFP (Figure 3). Ce faible pourcentage de GFP peut limiter l’utilisation de la GFP comme lecture robuste pour quantifier la neutralisation des anticorps, par rapport au rapporteur Luc, qui quantifie l’ensemble de la population de cellules infectées.
Lors de l’exécution du test de neutralisation, il est essentiel de changer les pointes de pipette entre les transferts de puits et de s’assurer que l’anticorps et le milieu sans sérum sont bien mélangés pour produire des résultats précis. De plus, lors de la mise en œuvre du protocole de test de la luciférase, les cellules doivent être complètement lysées pendant au moins 3 minutes pour assurer la lyse complète des cellules et la libération de l’enzyme luciférase. Cela garantira la précision du test. De plus, une fois que la solution de test de luciférase Firefly est ajoutée aux plaques optiques à parois blanches de 96 puits, la plaque doit être analysée dans les 10 minutes car l’émission lumineuse initiale est élevée mais diminue avec le temps à mesure que l’ATP s’épuise21.
Alors que de plus en plus de variants du SRAS-CoV-2 continuent d’évoluer, il est de plus en plus nécessaire de disposer de plateformes comme Ha-CoV-2 pour dépister rapidement l’infectiosité des variants et la sensibilité des variants aux anticorps neutralisants induits par le vaccin. La plateforme Ha-CoV-2 offre une vitesse plus rapide, un rapport signal/bruit plus élevé et un protocole simple par rapport aux tests de neutralisation existants basés sur les pseudovirus 8,9,10,11. La plateforme Ha-CoV-2 offre également l’avantage de pouvoir être utilisée dans les laboratoires BSL-2 et de ne pas nécessiter l’utilisation d’installations BSL-3. Cela permet de poursuivre la recherche sur le SRAS-CoV-2 dans des laboratoires de recherche et cliniques communs. De plus, la plateforme Ha-CoV-2 produit des résultats rapides par rapport à d’autres systèmes. Par exemple, l’étude des anticorps neutralisants contre le virus infectieux SARS-CoV-2 utilise souvent le test de neutralisation par réduction de la plaque (PRINT)22. Bien que PRINT produise des résultats fiables, le comptage manuel des unités formant des plaques (FFU) est lent et nécessite 3 à 5 jours pour obtenir des résultats23,24. D’autres systèmes de pseudotypes, tels que le pseudovirus lentivirus, ont besoin de 24 à 72 heures pour produire un signal rapporteur détectable12. En comparaison, le test de neutralisation du Ha-CoV-2 peut générer des résultats en 18 heures. Le Ha-CoV-2 fournit un outil pratique pour le dépistage et la quantification rapides des variants viraux et des anticorps neutralisants pour la surveillance de la pandémie.
La surveillance de l’infectiosité du SRAS-CoV-2 est essentielle alors que de plus en plus de variants préoccupants continuent d’émerger. Le Ha-CoV-2 offre l’avantage de déterminer rapidement l’infectiosité des COV. Des études antérieures ont utilisé la modélisation basée sur l’intelligence artificielle (IA) pour analyser quantitativement l’infectiosité du sous-variant Omicron et des autres variants du SRAS-CoV-2, tels que le variantDelta 25. Ces études ont montré que le variant Omicron est plus contagieux que le virus original et plus susceptible d’échapper aux anticorps neutralisants25. Dans ces études, utilisant Ha-CoV-2, des phénotypes similaires ont été observés. De plus, dans les tests de neutralisation des anticorps, le variant Omicron a dix fois moins de chances d’être neutralisé par 27BV que les souches Wuhan et Delta. Ces résultats sont également cohérents avec la transmissibilité plus élevée du variant Omicron, qui présente au moins 15 mutations sur son domaine de liaison au récepteur (RBD), ce qui augmente probablement l’affinité de liaison virale au récepteur ACE2 pour une transmissibilité plus élevée et un plus grand échappement immunitaire26.

En mai 2023, il y avait maintenant plus de 766 millions de cas de COVID-191. Malgré les campagnes de vaccination mondiales, le SRAS-CoV-2 circule et infecte continuellement les gens, en grande partie en raison de l’émergence de nouveaux variants tels que Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529) qui entraînent de nouvelles vagues d’infection 2,3,4. Étant donné que le SRAS-CoV-2 évolue constamment, il est important de mettre au point des tests rapides capables de mesurer avec précision l’infectiosité des variants émergents et l’efficacité des anticorps neutralisants induits par le vaccin contre ces variants. Ces tests sont essentiels pour la surveillance de la pandémie et pour déterminer l’efficacité des vaccins et de leurs rappels spécifiques aux variants.
En raison de la nature hautement contagieuse du SRAS-CoV-2, le Center for Disease Control and Prevention (CDC) exige que l’étude du SRAS-CoV-2 et de ses variants soit menée dans des installations de niveau de biosécurité (BSL) 3 5,6. Cette exigence BSL-3 limite l’utilisation de virus vivants pour quantifier l’infectiosité des variants viraux et de leurs anticorps neutralisants dans les laboratoires de recherche et cliniques courants. De plus, les tests traditionnels de neutralisation du SRAS-CoV-2, tels que les tests basés sur les effets sur les plaques ou les cytopathies utilisant des virus vivants compétents pour la réplication, prennent du temps et nécessitent de longues périodes d’incubation7. Plusieurs pseudovirus du SRAS-CoV-2 pseudotypés à protéine de pointe (S) ont été développés pour quantifier l’efficacité des anticorps neutralisants 8,9,10,11,12. Dans le cas du SRAS-CoV-2, la protéine S est la principale protéine qui médie l’entrée virale13 et est le principal antigène utilisé dans les vaccins contre le SRAS-CoV-2 9,10,14,15,16. Les virions pseudotypés par la protéine S, tels que ceux du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G) ou du lentivirus, ont été utilisés pour la quantification des anticorps neutralisants 17,18,19. Néanmoins, le pseudovirus à base de lentivirus nécessite normalement 2 à 3 jours d’infection afin de quantifier les signaux rapporteurs. Les systèmes de pseudovirus basés sur VSV contiennent souvent des virus VSV résiduels, ce qui peut entraîner des taux élevés de résultats faussement positifs et nécessite généralement 24 heures d’infection20.
Un nouveau système de pseudovirus du SRAS-CoV-2, le pseudovirus hybride alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), a été récemment développé par Hetrick et al12. Ha-CoV-2 fournit un nouvel outil pour la quantification rapide de l’infectiosité du virus et de la sensibilité du virus aux anticorps neutralisants dans les laboratoires BSL-2 courants. Structurellement, Ha-CoV-2 ressemble à la particule de virion du SRAS-CoV-2, constituée de protéines structurelles du SRAS-CoV-2, notamment la protéine S (S), la membrane (M), la nucléocapside (N) et l’enveloppe (E), et il n’y a pas de protéine structurelle d’autres virus. De plus, la particule Ha-CoV-2 contient un génome d’ARN à expression rapide provenant d’un alphavirus pour une expression rapporteure rapide dans les cellules. Il a été démontré que le Ha-CoV-2 mesure rapidement l’activité neutralisante des anticorps dans le sérum des personnes vaccinées et convalescentes12. Comme l’ont démontré Hetrick et coll., lorsqu’on le compare au pseudovirus du SRAS-CoV-2 à base de lentivirus dans un essai temporel, le Ha-CoV-2 exprimait le rapporteur de Luc dès 2 à 4 heures après l’infection, tandis que le pseudovirus lentivirus exprimait Luc après 24 h12. En outre, l’application potentielle des variants Ha-CoV-2 pour quantifier les anticorps neutralisants est démontrée en utilisant un anticorps neutralisant monoclonal standard, 27BV (voir figure supplémentaire 1)12. Ce travail détaille l’utilisation de la plateforme Ha-CoV-2 pour la quantification rapide de l’infectiosité des variants du SARS-CoV-2, en utilisant les variants Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529) comme exemples. En outre, l’application potentielle des variants Ha-CoV-2 pour quantifier les anticorps neutralisants est démontrée en utilisant un anticorps neutralisant monoclonal standard, 27BV12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>27VB1 20 &#181;g SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>27VBI-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL - US Origin FBS</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat# 24-300&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2043-30-1158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlowMax Discover Microplate reader</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>GM3000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 E Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 M Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 N Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 WT S Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_WT S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hek293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays</td>
			<td>Gold Bio&#160;</td>
			<td>I-930-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, &#956;Clear White Flat Round, Chimney)&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>Cat# 82050-758&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAlphaPro-Luc-GFP-Pre&#936; (Ha-CoV-2 Genome) Vector&#160;</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-based Transfection Reagent</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Transfectin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A43163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Ready-To-Use-Cells</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S&#160; Omicron (B.1.1.529) Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2-B.1.1.529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)&#160;Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2- B.1.617.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PES, 0.22&#181;m</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4444432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of ha-cov-2 pseudovirus for rapid quantification of sars-cov-2 variants and neutralizing antibodies

La pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a mis en évidence la nécessité de tests rapides pour mesurer avec précision l’infectiosité des variants émergents du SRAS-CoV-2 et l’efficacité des anticorps neutralisants induits par le vaccin contre les variants viraux. Ces tests sont essentiels pour la surveillance de la pandémie et la validation des vaccins et des rappels spécifiques aux variants. Ce manuscrit démontre l’application d’un nouveau pseudovirus hybride alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) pour la quantification rapide de l’infectiosité des variants du SARS-CoV-2 et des anticorps neutralisants induits par le vaccin contre les variants viraux. Le Ha-CoV-2 est une particule semblable au virus SARS-CoV-2 composée de protéines structurelles virales (S, M, N et E) et d’un génome d’ARN à expression rapide dérivé d’un alphavirus, le virus de la forêt de Semliki (SFV). Ha-CoV-2 contient également des gènes rapporteurs de la protéine fluorescente verte (GFP) et de la luciférase qui permettent une quantification rapide de l’infectiosité virale. À titre d’exemple, l’infectiosité des variants Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529) du SRAS-CoV-2 est quantifiée, et leur sensibilité à un anticorps neutralisant (27VB) est également mesurée. Ces exemples démontrent le grand potentiel de Ha-CoV-2 en tant que plateforme robuste pour la quantification rapide des variants du SARS-CoV-2 et leur sensibilité aux anticorps neutralisants.

As of May 2023, there have now been more than 766 million COVID-19 cases1. Despite worldwide vaccination campaigns, SARS-CoV-2 continuously circulates and infects people, largely due to the emergence of new variants such as Delta (B.1.617.2) and Omicron (B.1.1.529) that drive new waves of infection2,3,4. Given that SARS-CoV-2 is constantly evolving, it is important to develop quick assays that can accurately measure the infectivity of emerging variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against these variants. These assays are essential for pandemic surveillance and for determining the efficacy of vaccines and their variant-specific boosters.
Due to the highly contagious nature of SARS-CoV-2, the Center for Disease Control and Prevention (CDC) requires that the study of SARS-CoV-2 and its variants is conducted in biosafety level (BSL) 3 facilities5,6. This BSL-3 requirement limits the use of live viruses for quantifying the infectivity of viral variants and their neutralizing antibodies in common research and clinical laboratories. In addition, traditional SARS-CoV-2 neutralization assays, such as the plaque- or cytopathic effect-based assays using replication-competent live viruses, are time-consuming and require long incubation periods7. Several spike (S) protein-pseudotyped SARS-CoV-2 pseudoviruses have been developed to quantify the effectiveness of neutralizing antibodies8,9,10,11,12. In SARS-CoV-2, the S protein is the major protein that mediates viral entry13, and is the main antigen used in SARS-CoV-2 vaccines9,10,14,15,16. The S protein-pseudotyped virions, such as those of the vesicular stomatitis virus (VSV-G) or lentivirus, have been used for the quantification of neutralizing antibodies17,18,19. Nevertheless, the lentivirus-based pseudovirus normally requires 2 to 3 days of infection in order to quantify reporter signals. VSV-based pseudovirus systems often contain residual VSV viruses, which can result in high rates of false-positive results and typically require 24 h of infection20.
A novel SARS-CoV-2 pseudovirus system, the hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), has been recently developed by Hetrick et al12. Ha-CoV-2 provides a new tool for the rapid quantification of virus infectivity and virus sensitivity to neutralizing antibodies in common BSL-2 laboratories. Structurally, Ha-CoV-2 resembles the SARS-CoV-2 virion particle, consisting of SARS-CoV-2 structural proteins including the S protein (S), the membrane (M), the nucleocapsid (N), and the envelope (E), and there is no structural protein from other viruses. Additionally, Ha-CoV-2 particle contains a rapid-expressing RNA genome from an alphavirus for fast reporter expression in cells. Ha- CoV-2 has been shown to quickly measure the neutralizing activity of antibodies in the sera of vaccinated and convalescent individuals12. As demonstrated by Hetrick et al., when compared with lentivirus-based SARS-CoV-2 pseudovirus in a time course assay, Ha-CoV-2 expressed the Luc reporter as early as 2-4 h post-infection while the lentivirus-pseudovirus expressed Luc after 24 h12. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a&#160; standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV (See Supplementary Figure 1)12. This work details the use of the Ha-CoV-2 platform for rapid quantification of the infectivity of SARS-CoV-2 variants, using the Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants as examples. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV12.

Pleins feux sur l’auteur : Un système de pseudotype de virus pour évaluer les sous-variants d’Omicron et les anticorps neutralisants dans la recherche sur le SRAS-CoV-2

Application du pseudovirus Ha-CoV-2 pour la quantification rapide des variants du SRAS-CoV-2 et des anticorps neutralisants

We have established two main findings in this protocol. First, our Ha-CoV-2 platform demonstrates that the newly emerged Omicron subvariant is more infectious than the original Wuhan strain. Additionally, Omicron subvariants are more resistant to neutralizing antibodies induced by previous strains.SARS CoV-2 research requires BSL-3 facilities, making it difficult for common laboratories to monitor SARS-CoV-2 variants and to quantify neutralizing antibodies. Our Ha-CoV-2 system is a pseudotype virus that can be used in common laboratories and provides a faster way to quantify viral variants and their sensitivity to neutralizing antibodies. Ha-CoV-2 is a virus-like particle that has all the structural proteins of SARS-CoV-2 and resembles SARS-CoV-2.Also, Ha-CoV-2 uses and alpha viral vector for robust and rapid gene expression, producing fast results and a high signal to noise ratio for great reproducibility.

Les particules de Ha-CoV-2 ont été assemblées à l’aide de cinq vecteurs d’ADN différents qui expriment le génome de l’ARN Ha-CoV-2 et les protéines structurelles (M, N, E et S) du SRAS-CoV-2 dans HEK293T cellules. Le vecteur protéique S varie en fonction de la variante S. La protéine S de la souche originale Ha-CoV-2 de Wuhan (type sauvage, Wt) a été utilisée comme témoin positif, et elle a été assemblée avec la protéine S de chacun des deux autres variants : le Delta (B.1.617.2) ou l’Omicron (B.1.1.529). Les mêmes M, N, E ont été utilisés dans toutes les variantes. Ha-CoV-2(Wt) et les particules variantes ont été collectés 48 heures après la cotransfection, puis utilisés pour infecter les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). L’infectiosité a été mesurée par l’expression de la luciférase 18 heures après l’infection. Dans ce système, des niveaux d’expression plus élevés du signal de la luciférase reflètent une infection plus élevée des cellules par Ha-CoV-2. Le signal de la luciférase a été normalisé avec des copies d’ARN génomique par RT-qPCR pour chaque variant. Comme le montre la figure 1, le variant Ha-CoV-2 Omicron a généré un signal 4 à 10 fois plus élevé que le Ha-CoV-2(Wt) original, ce qui suggère une infectiosité plus élevée.
En outre, la capacité du 27BV à neutraliser les variants HaCoV-2(Wt), Delta et Omicron a été quantifiée. 27BV est un anticorps monoclonal de lapin qui a été développé contre le domaine RBD de la protéine S1 du SRAS-COV-2. Pour les tests de neutralisation, des dilutions en série de 27BV ont été effectuées dans une plaque de 96 puits, pré-incubées avec Ha-CoV-2, puis ajoutées à des cellules cibles HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Les résultats ont démontré que le 27BV avait une activité neutralisante contre tous les variants testés (Figure 2). Il est intéressant de noter que l’ID50 du 27VB pour Omicron était environ 10 fois moins puissant que l’ID50 pour Ha-CoV-2(WT) et Ha-CoV-2(Delta ; Figure 2). Ces résultats démontrent que la plateforme Ha-COV-2 peut être utilisée comme méthode rapide pour quantifier les anticorps neutralisants induits par le vaccin dans les variants émergents.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig01.jpg"> Graphique 1. Assemblage et quantification des variants du Ha-CoV-2. (A) Illustration de l’assemblage du Ha-CoV-2 et des particules variantes. Les vecteurs exprimant le génome rapporteur de Ha-CoV-2 et les protéines structurelles (M, S, N et E) sont cotransfectés dans HEK293T cellules. Les particules ont été récoltées 48 h après la cotransfection (l’imagerie des particules de virion et des cellules HEK293T a été créée avec Biorender.com). (B) Quantification de l’infectiosité des variants Ha-CoV-2. L’infectiosité relative des deux variants (Delta et Omicron) est quantifiée et normalisée à l’aide de copies d’ARN génomique de variants individuels du Ha-CoV-2 (Luc). Le type sauvage est le Ha-COV-2 (Wt), qui est utilisé comme contrôle pour la comparaison. Des tests d’infection et de luciférase ont été effectués 3x. RU, unité relative. La moyenne et l’écart-type (ET) sont indiqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig02.jpg"> Graphique 2. Quantification de l’activité de neutralisation du 27BV contre les variants Ha-CoV-2(Luc) L’activité de neutralisation du 27BV a été analysée 18 heures après l’infection des cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). L’ID50 a été calculé en utilisant le taux d’infection relatif (activité de la luciférase) par rapport à la concentration de 27BV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig03.jpg"> Graphique 3. Infection de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) par Ha-CoV-2(GFP). Les particules de Ha-CoV-2(GFP) ont été assemblées puis utilisées pour infecter les cellules HEK293T(ACE2/TMPRSS2). L’expression de la GFP a été observée 48 heures après l’infection par microscopie fluorescente. Le champ blanc des cellules infectées est montré à gauche et l’imagerie GFP est montrée à droite. La barre blanche représente 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1. Résumé graphique. La structure et l’application du pseudovirus Ha-CoV-2. Image créée avec Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Graphical%20Abstract_RE.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 1. Séquences de protéines. Liste des séquences des protéines S, M, N et E du SARS-CoV-2. Les séquences de la protéine S comprennent également les variants du SRAS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) et Delta (B.1.617.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Protein%20Sequences_joVE_RE.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies at JoVE.com

Ce protocole décrit l’application d’un nouveau pseudovirus hybride alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) comme plateforme pour la quantification rapide de l’infectiosité des variants du SARS-CoV-2 et de leur sensibilité aux anticorps neutralisants.

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Nous avons établi deux conclusions principales dans ce protocole. Tout d’abord, notre plateforme Ha-CoV-2 démontre que le nouveau sous-variant d’Omicron est plus infectieux que la souche originale de Wuhan. De plus, les sous-variants d’Omicron sont plus résistants aux anticorps neutralisants induits par les souches précédentes.La recherche sur le SRAS-CoV-2 nécessite des installations BSL-3, ce qui rend difficile pour les laboratoires ordinaires de surveiller les variants du SRAS-CoV-2 et de quantifier les anticorps neutralisants. Notre système Ha-CoV-2 est un pseudotype de virus qui peut être utilisé dans les laboratoires courants et offre un moyen plus rapide de quantifier les variants viraux et leur sensibilité aux anticorps neutralisants. Le Ha-CoV-2 est une particule semblable à un virus qui possède toutes les protéines structurelles du SRAS-CoV-2 et ressemble au SRAS-CoV-2.De plus, Ha-CoV-2 utilise un vecteur viral alpha pour une expression génétique robuste et rapide, produisant des résultats rapides et un rapport signal/bruit élevé pour une grande reproductibilité.

application-ha-cov-2-pseudovirus-for-rapid-quantification-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

711 vues.  George Mason University. Nous avons établi deux conclusions principales dans ce protocole. Tout d’abord, notre plateforme Ha-CoV-2 démontre que le nouveau sous-variant d’Omicron est plus infectieux que la souche originale de Wuhan. De plus, les sous-variants d’Omicron sont plus résistants aux anticorps neutralisants induits par les souches précédentes.La recherche sur le SRAS-CoV-2 nécessite des installations BSL-3, ce qui rend difficile pour les laboratoires ordinaires de surveiller les variants d...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Un système de pseudotype de virus pour évaluer les sous-variants d’Omicron et les anticorps neutralisants dans la recherche sur le SRAS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Recherche

Immunologie et infection

Assembling Ha-CoV-2 Particles by Cotransfection of HEK293T Cells for Quantification of SARS-CoV-2 Variants

Begin by maintaining HEK293T cells and DMEM containing heat inactivated FBS, Penicillin, and Streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of trypan blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber and count the number of cells per milliliter.Seed HEK293T cells and 10 milliliters of complete DMEM in a 10 centimeter cell culture Petri dish. Incubate the cells overnight in a carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. The next day, remove the complete medium and replace it with nine milliliters of DMEM serum-free medium.Using the given compounds of viral particle assembly, prepare a cotransfection mixture. Slowly add the mixture to the Petri dish, and incubate at 37 degrees Celsius for six hours. After incubation, replace the serum-free DMEM with a complete DMEM medium and continue incubation for cotransfection for up to 48 hours.Then detach the cells by repeatedly pipetting over the surface of the monolayer and transfer the suspension into a 15 milliliter tube. Centrifuge the cell suspension at 400G for five minutes. Collect the supernatant and pass it through a 0.22 micron filter.Store the filtrate containing Ha-CoV-2 pseudovirus at 80 degrees Celsius.

Assemblage de particules de Ha-CoV-2 par cotransfection de cellules HEK293T pour la quantification des variants du SARS-CoV-2

Quantification of Ha-CoV-2 Variants and 27BV Neutralization Activity Against Ha-CoV-2(Luc) Variants

Begin by maintaining HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in DMEM containing heated activated FBS, penicillin, and streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of Trypan Blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber, and count the number of cells per milliliter.Seed 2.5 times 10 to the power of four HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in 50 microliters of complete DMEM medium into each well of a 96-well plate. Incubate the cells in a carbon dioxide incubator overnight at 37 degrees Celsius. The next day, replace the 50 microliters of DMEM with 50 microliters of virus suspension, and incubate for 18 hours at 37 degrees Celsius.After incubation, add 7.5 microliters of cell lysis buffer to each well, and mix on an orbital shaker for two minutes. Once the cells are lysed, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix them on an orbital shaker for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.For neutralizing antibody assay, seed HEK-293T cells in 50 microliters of complete DMEM as demonstrated previously. In a 96-well plate, add eight microliters of 27 BV neutralizing antibody, and perform serial dilutions with six microliters of serum-free DMEM. Add 54 microliters of Ha-CoV-2 virus particle to the serially diluted antibody, and mix the suspension.Incubate for one hour at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide. Then add 50 microliters of virus suspension to the wells containing HEK-293T cells. For controls, add 50 microliters of complete DMEM medium into the wells containing only HEK-293T cells.Place the plate in an incubator at 37 degrees Celsius for 18 hours. After lysing the cells as demonstrated previously, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix by orbital shaking for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.Ha-CoV-2 Omicron and Omicron variants generated four to tenfold higher signal than the Wild-type Ha-CoV-2, suggesting higher infectivity. The antibody 27 BV demonstrated neutralizing activity against both Delta and Omicron variants. The ID50 of 27 BV for Omicron was approximately 10 times less potent than the ID50 for Wild-type and Delta.