Cet essai lie la modulation de la structure bactérienne et de la fonction à l’activité antibactérienne à base de cellules immunitaires. En tant que tel, un immunothérapeutique clé d’un traitement potentiel peut être évalué en déterminant la probabilité d’une meilleure dégagement bactérien. L’analyse opsonophagocytique de mise à mort sert traditionnellement d’étalon-or pour évaluer les fonctions efficaces des anticorps soulevés contre la bactérie comme obsonnants.
Ce protocole offre simplicité et polyvalence par rapport aux analyses standardisées à haut débit existantes. Dans ce protocole, nous étudions les effets d’un traitement médicamenteux sur la pneumonie streptocoque et comment ces effets se traduisent par une phagocytose améliorée de la bactérie. Ici, nous appliquons l’OPKA aux cellules de pneumonie streptocoque.
Cependant ce protocole peut être adopté pour évaluer le meurtre phagocytique d’autres agents pathogènes par les cellules immunitaires. Consacrez du temps à optimiser les stocks bactériens et à vous assurer que les CFC finaux à compter se trouvent dans la plage optimale. Nous recommandons fortement d’utiliser la cytométrie du débit pour nous assurer que les cellules HL60 sont viables et actives et d’essayer différentes conditions de culture pour assurer des cellules fonctionnellement actives.
La démonstration visuelle permettra de mieux comprendre comment l’échantillon doit être plaqué et comment obtenir des échantillons dénombrés. Pour commencer, préparez des supports de culture cellulaire HL60 composés de 500 millilitres RPMI complétés par de la L-glutamine et de 15 millilitres de sérum bovin fœtal inactivé. Pour la propagation et le maintien des cellules HL60, la culture de cinq millions de cellules dans 10 millilitres de HL60 corps de culture cellulaire dans 75 centimètres carrés ventilés flacons à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone.
Pour générer des stocks de travail de cellules HL60, ajouter environ un million de cellules par millilitre dans les médias de culture HL60 complétées par du sulfure de diméthyle de 10 % en tubes cryogéniques d’un millilitre. Pour différencier les cellules HL60, la culture 1,5 fois 10 aux sept cellules dans 15 millilitres de HL60 médias de culture cellulaire complétée par 0,6%DMF dans le filtre stérile plafonné 75 flacons centimètre carré à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours avant OPKA. Pour préparer les échantillons de bouillon bactérien, faire pousser la souche bactérienne WU2 dans un bouillon approprié pendant environ deux à quatre heures à 37 degrés Celsius.
Ensuite, pelleter les bactéries par centrifugation à six mille fois G pendant deux minutes et resuspendre les cellules en 10 à 30 millilitres de 15% glycérol dans le bouillon approprié. Aliquot la culture des bactéries dans stériles 1,5 millilitres tubes centrifugeuses et stocker à 80 degrés Celsius. Ensuite, décongelez un flacon de bouillon bactérien dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.
Pelleter les cellules bactériennes et les résuser dans 500 microlitres d’OBB dans des conditions stériles. Les dilutions des plaques du stock bactérien non traité sur les plaques d’agar sanguin et la culture des plaques pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Après l’étape d’incubation, compter les colonies pour chaque dilution du stock bactérien non traité co-cultivé avec les cellules HL60.
Enregistrez quelle dilution des bactéries donne le nombre optimal de colonies dénombrées pour les futurs OPCA avec ce stock bactérien. Décongeler un tube de bouillon bactérien. Bactéries granulés à six mille fois G pendant deux minutes et de résuspendre la pastille cellulaire dans OBB à la dilution optimale obtenue dans l’étape précédente.
Pipette 10 microlitres de la dilution bactérienne résuspendue par puits dans une plaque ronde de culture de cellules de 96 puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’un anticorps approprié ou d’un traitement médicamenteux à chaque puits expérimental en double. Pour les puits de contrôle, utilisez 1XPBS ou OBB selon le tampon utilisé pour les puits de traitement.
Agiter la plaque d’échantillon à environ 90 rpm à température ambiante pendant une heure. Pour récolter les cellules différenciées HL60 qui sont traitées avec DMF trois jours avant, pelleter les cellules à 500 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille avec au moins 10 millilitres de 1XPBS.
Pelleter les cellules lavées à 500 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans OBB. Ajouter le sérum stérile non dilué de lapin de bébé à un à cinq volume final.
Après une culture bactérienne d’une heure, diviser chaque échantillon en puits en double pour deux groupes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du mélange HL60 complément à chaque ensemble expérimental de puits et 50 microlitres d’OBB aux puits de bactéries seulement. Agiter la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Pour plaquer les échantillons, diluer chaque puits avec de l’OBB à un volume final d’un à cinq afin que chaque échantillon ait un volume d’au moins 50 microlitres. Ensuite, pipette 50 microlitres de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, assurant un espacement adéquat entre les échantillons. Couvrir et laisser sécher les échantillons pendant environ 15 minutes à température ambiante.
Inverser les assiettes et la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Alternativement, plaques de culture dans des pots anaérobies pour tester si les conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou pour contrôler la morphologie. Après la culture du jour au lendemain, comptez les colonies dans chaque zone d’échantillonnage désignée et procédez à l’analyse des données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque ensemble aux contrôles correspondants.
Les aspects les plus difficiles de l’établissement de cette technique pour la première fois seront probablement l’optimisation des CFUs de départ du stock bactérien, ainsi que de s’assurer que les cellules HL60 sont effectivement différenciées. Avant de commencer l’OPKA, la différenciation HL60 a été validée à l’aide de la cytométrie du débit avec l’iodure propidium comme marqueur de viabilité. Après avoir été traité avec DMF pendant trois jours, l’expression de CD35 a été augmentée et l’expression de CD71 a été diminuée.
Les pourcentages moyens d’FC bactériennes dans les groupes traités HL60 par rapport aux groupes traités non-HL60 correspondants ont été utilisés pour comparer la survie des cellules bactériennes de différents traitements. Les résultats ont montré qu’avec un traitement efficace, le nombre de colonies était différent entre la co-culture HL60 et aucune cellule HL60, ce qui indique une phagocytose plus efficace. Les résultats ont montré que lorsque la dilution bactérienne n’était pas optimisée ou que la croissance de la colonie n’était pas soigneusement observée après placage, la prolifération des colonies pouvait empêcher un comptage précis des colonies.
La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de surveiller attentivement l’incubation bactérienne afin d’éviter la prolifération des FC. Les analyses in vivo peuvent être utilisées pour évaluer le dégagement bactérien efficace au sein d’un hôte. Ces analyses peuvent être utilisées pour confirmer que l’efficacité immunitaire observée avec l’OPKA est traduisible en modèles humains ou animaux.
L’essai de mise à mort opsonophagocytic a été employé à grand effet dans les études significatives précédentes de recherche pour lier des thérapies antibactériennes aux réponses immunisées phagostiques. Travailler avec des agents pathogènes bactériens peut être dangereux. S’il vous plaît porter de l’équipement personnel de protection en tout temps au cours de cet essai.
