Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

Pour commencer, préparez une plaque à 1,8 % d’agarose avec du milieu E3 tamponné HEPES ou E3. Tout en travaillant sous un microscope à dissection, placez six à 10 larves anesthésiées en ligne sur la plaque d’agarose. Placez une épingle à insectes sur la tête de chaque larve. Retirez ensuite le reste de l’E3 de la plaque à l’aide d’un mouchoir en papier.

À l’aide d’une autre épingle à insectes, isolez l’intestin d’une larve sans perturber les autres organes. Assurez-vous que le jaune d’œuf est bien enlevé. Une fois isolé, inspectez l’intestin et retirez tous les matériaux non intestinaux, tels que la peau, la graisse ou le foie.

Utilisez une pince à épiler pour recueillir l’intestin et le transférer dans du PBS contenant 10 % de FCS dans un tube de microcentrifugation placé sur de la glace. Immédiatement après la dissection de tous les intestins, centrifugez le tube de microcentrifugation à 13 800 g pendant 30 secondes. Retirez le surnageant en laissant environ 100 microlitres dans le tube pour éviter que les intestins ne se dessèchent.

Ajouter 500 microlitres de solution de papaïne aux intestins dans le tube. Activez la papaïne en ajoutant 2,5 microlitres d’une molaire cystéine. Ensuite, incubez le tube contenant les intestins dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Pipetez le contenu de haut en bas à mi-chemin après cinq minutes pour stimuler la digestion enzymatique des tissus. Transférez les cellules dissociées dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS, à travers une crépine cellulaire pré-mariée de 35 microns. Lavez la passoire plusieurs fois en ajoutant 0,5 millilitre de PBS contenant 10 % de FCS pour un volume de lavage total de deux millilitres.

Centrifuger le filtrat collecté à 700 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius et retirer le surnageant. Ajouter un microgramme par millilitre de DAPI à 300 microlitres de PBS contenant 10 % de FCS. Ajoutez ce mélange à la pastille et remettez-la en suspension pour étiqueter les cellules mortes.

Ensuite, incuber pendant cinq minutes sur de la glace pour permettre leur exclusion lors de l’analyse FACS ultérieure.