Les auteurs tiennent à remercier Bob Freeman pour la formation et le laboratoire de Kirschner pour l&#39;utilisation de la facilité de grenouille, et des membres du laboratoire Vactor Van de soutien. Nous remercions le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School de l&#39;aide pour la microscopie optique pour les images de la figure 1. Ce travail a été financé par le texte suivant: NRSA NIH bourse et les NIH K99 bourse à LAL, Basic Science Partnership financement ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) à l&#39;AEF, et les NIH RO1 NS035909 de DVV

Remarque: Nous décrivons les étapes décrites dans les deux premières sections seulement en bref, que des protocoles d&#39;excellentes avec des informations détaillées ont été publiées ailleurs qui se concentrent plus spécifiquement sur ​​ces mesures (par exemple 8-12). En outre, le protocole général de travailler avec les neurones spinaux Xenopus dans la culture de cellules vivantes a déjà été publié dans un article détaillé méthodes 8. Nous recommandons vivement revoir cet article comme un complément à cette vidéo, même si ici on ne fournir suffisamment d&#39;informations pour effectuer avec succès et dépanner la dissection du tube neural et le protocole de placage à l&#39;étape 3. 1. Fécondation In Vitro œufs de Xenopus <ol><li> Obtenir des œufs de grenouilles femelles qui ont été injectés avec la gonadotrophine chorionique (400 unités / grenouille) 12-18 heures avant la collecte des œufs. Ramassez les œufs dans une solution 1X Marc Ringer modifiée (MMR) (0,1 M de NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM de CaCl 2, 5,0 mM d&#39;HEPES, pH 7,4) 9. </li><li> Féconder les oeufs in vitro avec des testicules hachés, comme décrit précédemment 9. </li><li> Après au moins 20 minutes, retirez embryon gelée manteau en incubant embryons en cystéine 2% ROR 1X (ajustée à pH 7,8 avec NaOH) pendant 3-5 min. Laver avec 0,1 X MMR (ou 0,1 x MBS (modification Saline Barth, recette 1X: 88 mM NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 mM de CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,8)) 3 embryons à 5 fois, et garder à température ambiante jusqu&#39;à ce que les injections, ou le cas échéant, les embryons lieu à 14-18 ° C pour ralentir le développement. </li></ol> 2. La micro-injection de l&#39;ARN Remarque: si nous utilisons l&#39;injection d&#39;ARN ici, ces techniques ne sont pas limités à l&#39;ARN et de l&#39;ADN, des protéines ou des acides nucléiques modifiés pour la manipulation génétique peuvent également être utilisés et ont été décrits précédemment 12. <ol><li> Avant d&#39;expérimentation, ARN pour l&#39;étiquetage des structures du cytosquelette ou d&#39;autres are transcrit à partir de matrices d&#39;ADN linéarisées en utilisant le kit mMessage mMachine (Ambion). ARNm nécessitent une coiffe en 5 &#39;et en 3&#39; de queue de polyadénylation, de promouvoir la traduction et prévenir la dégradation de l&#39;embryon. pCS2 + est un vecteur couramment utilisé à cette fin, et le kit de transcription comprend un analogue de cap au cours de la réaction de synthèse. Nous remettre en suspension dans l&#39;ARNm transcrit sans nucléase ddH 2 0, à une concentration stock entre 500 et 2.000 ng / ul, suivie d&#39;un stockage rapide à -80 ° C. Avant l&#39;injection, diluer l&#39;ARN dans ddH 2 0 à la concentration appropriée pour l&#39;injection. Étant donné que seul un petit volume seront injectées dans des embryons, la remise en suspension dans du tampon n&#39;est pas nécessaire. Notre concentration d&#39;injection final est généralement de 50 à 200 pg / nl, en fonction de la construction, et nous avons l&#39;habitude va injecter jusqu&#39;à 4 nl par embryon, bien que de nombreux laboratoires traditionnellement injecter jusqu&#39;à 10 nl, ce qui représente environ 1% du volume total des un embryon. ARN peut être toxique à fortes doses, et la dose par genres embryonlly varie de 10 pg à 1 ng, bien que jusqu&#39;à 5 ng peut être toléré en fonction de la gène particulier et de la pureté. Cependant, pour la localisation des protéines d&#39;imagerie, le niveau le plus bas possible devrait être injecté pour éviter la sur-expression des artefacts. ARN pour EB1-GFP dans ce protocole est utilisé au montant final de 250 pg par embryon. </li><li> Préparer aiguilles d&#39;injection capillaire en tirant avec une aiguille de traction 9, à un diamètre de pointe de ~ 0,2 um. Avec une Sutter P-87 extracteur, nous utilisons les paramètres suivants: chaleur 644, traction 125, vitesse 70, temps de 250, mais ces paramètres diffèrent en fonction de la machine et doit être réajusté après avoir changé le filament (nous utilisons actuellement de 2,5 mm filament carré qui est de 2,5 mm de large). Sous un microscope, briser pointe de l&#39;aiguille avec une pince à un angle de générer une forme plume-like. Il existe d&#39;autres méthodes pour briser et le remplissage des aiguilles d&#39;injection (par exemple 11,12), mais nous remplissons l&#39;aiguille avec de l&#39;ARN en plaçant une petite goutte (0,5 - 1 pl) à l&#39;extrémité arrière de laaiguille. Pour micro-injection dans des embryons, il ya un certain nombre de systèmes d&#39;injection disponibles dans le commerce, deux des plus courantes étant le Pico-injecteur (Medical Systems), et le Nanoject (Drummond Scientific) (voir 11 pour plus d&#39;informations). Nous utilisons le Medical Systems PLI-100 Pico-injecteur, qui utilise du gaz comprimé pendant une période de temps définie numériquement afin de livrer des volumes nanolitre cohérentes. Volume d&#39;injection doit être calibré pour chaque micropipette nouveau en utilisant un micromètre, et le temps d&#39;injection doit être ajustée pour obtenir la quantité désirée de l&#39;ARN injecté. </li><li> Lieu fécondé embryons au 1 - à 4-cell étape dans un plat en plastique contenant 5% de Ficoll à 0,1 X MMR. Maintien en place de l&#39;embryon avec des pinces, ou placer dans une plate-forme de support (une maille plastique, avec une grille de ~ 1 mm, collée au fond du récipient avec la pâte à modeler ou de la cire dentaire), injecter dans le volume désiré blastomères animaux (voir l&#39;étape 2,1 Pour plus de détails concernant les volumes d&#39;injection). Distribuer dans plusieurs loctions tout au long de l&#39;embryon, au moins une injection dans chacun des blastomères animaux, pour obtenir une répartition plus uniforme (par exemple, pour un embryon au stade de 4 cellules, nous avons généralement injecter 1-2 fois dans chaque blastomère, alors que dans un stade 2-cellules embryon, on injecte 2-4 fois dans chaque blastomère). Un autre avantage de l&#39;attente jusqu&#39;à ce que le stade 2-4 cellules est de vous assurer que l&#39;embryon a commencé à s&#39;attacher normalement. Toutefois, si le temps est de l&#39;essence, vous pouvez commencer à l&#39;étape 1-cellule, avec peu de différence dans le résultat final autre que plus d&#39;embryons devant être injectée. Embryons à un stade plus âgés peuvent aussi être utilisés, ce qui est particulièrement utile si des types cellulaires spécifiques sont ciblés pour l&#39;injection, mais que nous préférons généralement une expression plus large, nous injectons dans les jeunes embryons de réduire le besoin d&#39;injections plus nombreux. </li><li> Transfert embryons injectés dans un plat en plastique contenant 0,1 X MMR et leur permettre de développer jusqu&#39;au stade 20-23 13. Incuber les embryons de 14 à 22 ° C en fonction spé désiréeed de développement. (Pour disséquer tube neural, le lendemain, utilisez ~ 22 ° C. Pour le lendemain, utilisez ~ 14 ° C) </li></ol> 3. Dissection du tube neural et placage <ol><li> Avant d&#39;effectuer les dissections, préparer les 14 boîtes de culture. Tout d&#39;abord, des lamelles manteau avec assez de solution de 200 pg / ml de poly-lysine dans du PBS à la piscine sur la surface de la lamelle, soit Mattek ou des boîtes de culture Lab-Tek, et incuber pendant une heure (en variante, on peut utiliser des lamelles de verre assis en vrac dans une boîte de Pétri, pour un placement plus tard sur lames de verre pour l&#39;imagerie et l&#39;immunocytochimie). Aspirer et laver avec un excès de PBS 3 fois, et laisser sécher. Puis plats manteau avec 10 ug / ml de laminine dans du PBS (nous utilisons habituellement 500 ul par lamelle, il suffit de piscine sur toute la surface) pendant une heure à 37 degrés. Aspirer la solution de laminine et laver 3 fois avec un excès de PBS, en faisant attention de ne pas laisser les surfaces revêtues de laminine être exposés à l&#39;interface air. Remplae PBS avec des milieux de culture (50% de Ringer, 49% de L-15 médias, 1% de sérum fœtal bovin, plus 50 pg / ml de pénicilline / streptomycine et la gentamicine, à pH 7,4 et stérilisé par filtration). (Media Ringer, 115 mM NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 10 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Bien que notre protocole utilise ce média, il convient de noter qu&#39;il s&#39;agit d&#39;un milieu enrichi commun pour les cultures de Xenopus plus ganglionnaires de la rétine, où les neurones ont réduit l&#39;énergie réservée. Jeunes cultures de la moelle épinière va survivre et croître pendant plus de 24 heures dans les médias Sonneries pures, sans autres facteurs de croissance, et c&#39;est bien là l&#39;un des avantages de l&#39;utilisation de ce système. Facultatif: Ajouter NT3 et le BDNF (pour des concentrations finales de 25 ng / ul chacun) pour les milieux de culture pour augmenter la croissance axonale. </li><li> En raison de la variabilité de l&#39;expression de l&#39;ARNm injecté, les embryons peuvent présenter une mosaïque de fluorescence. Avant d&#39;effectuer les dissections, les embryons d&#39;écran pour la présence de fluorescence, à identifier les embryons qui expRESS la protéine de fusion fluorescente dans le tube neural. Placer les embryons au stade 20-23 fluorescentes dans un plat d&#39;agarose à revêtement en matière plastique rempli de médias Steinberg (58 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 0,44 mM de Ca (NO 3) 2, 1,3 mM de MgSO 4, 4,6 mM de Tris, pH 7,8, puis à autoclave) 5. Pour rendre le plat d&#39;agarose-enduit, fond plat couche de plastique fondu avec 1% d&#39;agarose dans 0,1 X MMR et laisser durcir. Cela donne une surface douce de façon que les dommages ne se produit pas aux pinces fines et les aiguilles de tungstène utilisé lors des étapes ultérieures de dissection. Dissection d&#39;embryons au-delà de l&#39;étape 23 est possible, mais il est plus difficile que les tissus se conformer plus étroitement les uns aux autres et nécessitent donc un traitement plus long avec de la collagénase. </li><li> Sous un microscope à dissection, retirez la membrane vitelline avec une pince fine, puis d&#39;isoler toute la partie dorsale de l&#39;embryon, en faisant une série d&#39;incisions. Alors une pince maintenir l&#39;embryon en place, utilisez le second pour faire une incision sur lecôté de l&#39;embryon pour exposer l&#39;intérieur creux. Ensuite, utiliser une pince pour pincer les deux le long du tissu entre les moitiés dorsale et ventrale de l&#39;embryon, ce qui réduit de moitié l&#39;embryon pour isoler la partie dorsale contenant le tube neural. </li><li> Placez l&#39;explant dorsale dans un tube Eppendorf de 2 mg / ml de collagénase dans les médias Steinberg pendant 15-20 min sur un agitateur, d&#39;assouplir les tissus, puis pipette explant dorsale en plastique agarose à revêtement plat avec une solution fraîche de Steinberg. Alternativement, l&#39;explant peut être placé dans une boîte de Pétri contenant la solution de collagénase pendant 15 min, où la dissection entière pourrait alors être effectuée. </li><li> En utilisant une paire de pinces, doucement disséquer le tube neural de l&#39;épiderme dorsal et ventral de la notocorde. Glisser la pointe de la pince entre l&#39;épiderme et des tissus sous-jacents et tirant lentement l&#39;épiderme, révélant le tube neural dessous. Ensuite, utilisez une pince pour tenir le tissu et un autre pour faire glisser la pointe entre letube neural et notocorde. Enfin, utilisez une pince pour retirer les somites de chaque côté du tube. </li><li> Transfert du tube neural dans un plat recouvert d&#39;agarose-rempli de milieux de culture, tel que décrit à l&#39;étape 3.1. </li><li> Après la collecte de plusieurs tubes neuraux, les couper en morceaux nombreuses (environ 20, si l&#39;ensemble du tube est isolé) en utilisant des aiguilles de tungstène affûtées ou des pinces, puis les morceaux de plaques dans des boîtes de culture remplis de milieu (préparé à l&#39;étape 3.1), l&#39;étalement les explants uniformément en rangées. </li><li> Après étalement, ne déplacez pas les plats parce que cela perturbe les cellules de fixation. Incuber les explants plaqués du tube neural autour de 20-22 ° C. En général, nous laisser le plat de cellules sur le banc à la température ambiante pendant une nuit. L&#39;un des avantages de Xenopus laevis neurones, c&#39;est que un incubateur spécial pour la culture cellulaire qui régule les niveaux de CO2 ou la température n&#39;est pas nécessaire. Neurites et des cônes de croissance peut être observé et imagé à 12 température ambiante-24 H après étalement, bien que l&#39;excroissance peut être accélérée par l&#39;ajout de facteurs de croissance. En général, l&#39;expression d&#39;un ARN ou un produit plasmide se traduira par une expression variable entre les cellules, et donc il peut y avoir une gamme de niveaux d&#39;expression de fluorescence entre les cônes de croissance. Nous avons observé l&#39;expression d&#39;ARN de protéines fluorescentes de persister au-delà de 48 heures après l&#39;étalement, même si cela dépend de la construction particulière. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Après avoir suivi le protocole, qui est résumée dans la figure 1A, en bonne santé, bien-disséqués et mis en culture des explants neuraux enverra axones de nombreux neurites ou dans tous les sens sur la laminine / poly-lysine substrat, illustré à la figure 1B. Les cônes de croissance à l&#39;extrémité des axones peuvent être visualisés soit par l&#39;optique DIC, comme on le voit dans la figure 1C, à la dynamique d&#39;image dans l&#39;ensemble, la motilité ou haute résolution microscopie à fluorescence pour examiner la localization de fluorescence marqués protéines du cytosquelette, par exemple, EB1-GFP est représenté sur la figure 1D. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> Figure 1. Résumé du protocole expérimental et les résultats attendus. A) Protocole organigramme. Voir la vidéo pour plus de détails concernant la dissection au jour 3. Le tube neural ensemble doivent être coupés en morceaux d&#39;environ 20 de taille égale et étaler uniformément en rangées sur la lamelle. Dans ce dessin, ciseaux sont présentés pour représenter couper le tissu avec des pinces fines. CG gonadotrophine chorionique B) image DIC ou des axones en croissance de neurites explant (explant dans le coin en haut à gauche). C) l&#39;image de grossissement supérieur du cône de croissance à l&#39;extrémité d&#39;un axone en croissance. D) Image en microscopie de fluorescence de la GFP dans EB1-cône de croissance. Barre d&#39;échelle 10 pm. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Xenopus laevis explants neuraux envoyer des neurites de façon très robuste de 24 heures après placage sur la laminine / poly-lysine substrat si les conditions s&#39;y prêtent. Avec ce substrat, des cônes de croissance sont très mobiles et peuvent atteindre des longueurs de l&#39;axone jusqu&#39;à 1 mm, s&#39;étendant dans toutes les directions vers l&#39;extérieur à partir de l&#39;explant, bien longueurs typiques sont 100 um ou plus. Si neurites ne se développent pas, il ya un nombre limité de rais...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La gonadotrophine chorionique </td><td> Argent Laboratoires Chimique </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cystéine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Capillaire Aiguilles Borosil 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Biologie Inox Pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Plats Mattek </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> La poly-L-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> TS3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

Le processus complexe de guidage axonal est largement déterminée par le cône de croissance, qui est la structure dynamique mobiles à la pointe de l&#39;axone en croissance. Au cours de la croissance axonale, le cône de croissance doit intégrer plusieurs sources d&#39;information signal de guidage de moduler son cytosquelette afin de propulser le cône de croissance avant et naviguer avec précision pour trouver ses objectifs spécifiques 1. Comment cette intégration se fait au niveau du cytosquelette est encore émergent, et l&#39;examen de protéine du cytosquelette et de la dynamique effectrices dans le cône de croissance peut permettre à l&#39;élucidation de ces mécanismes. Cônes de Xenopus laevis de croissance sont assez grande (10-30 microns de diamètre) pour effectuer de résolution imagerie en temps réel de la dynamique du cytosquelette (par exemple 2-4) et sont faciles à isoler et manipuler dans un laboratoire par rapport à d&#39;autres vertébrés. La grenouille est un système modèle classique pour les études de la neurobiologie du développement, et d&#39;importantes réflexions précoces en micro cône de croissancedynamique rotubule ont d&#39;abord été trouvés en utilisant ce système 5-7. Dans cette méthode 8, les œufs sont recueillis et fécondés in vitro, injection de l&#39;ARN codant pour des protéines de fusion marquées par fluorescence du cytosquelette ou d&#39;autres constructions pour manipuler l&#39;expression des gènes, puis on le laisse se développer jusqu&#39;au stade du tube neural. Tube neural sont isolées par la dissection, puis sont cultivées, et les cônes de croissance des neurites sur l&#39;étroit sont imagés. Dans cet article, nous décrivons comment effectuer cette méthode, dont le but est de culture cônes de Xenopus laevis de croissance pour l&#39;analyse d&#39;images à haute résolution ultérieure. Bien que nous apportions l&#39;exemple de la protéine de fusion + TIP EB1-GFP, cette méthode peut être appliquée à n&#39;importe quel nombre de protéines d&#39;élucider leurs comportements dans le cône de croissance.

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

La culture des explants neuraux de disséqué<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons qui expriment des protéines de fusion fluorescentes pour l&#39;imagerie permet de dynamique de croissance du cytosquelette cône.

Des cultures d&#39;explants neuraux de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

12.5K vues.  Harvard Medical School. La culture des explants neuraux de disséqué Xenopus laevis Embryons qui expriment des protéines de fusion fluorescentes pour l'imagerie permet de dynamique de croissance du cytosquelette cône.

Vidéo: Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Formant Colonie dosage cellulaire: Un test pour distinguer Bona Fide Cellules souches neuronales à partir de cellules progénitrices neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

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Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerf-muscle co-cultures

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

Enregistrements simultanés des potentiels corticaux champ Local, électrocardiogramme, électromyogramme et respiration rythmique d’un Rat librement mobile

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...