Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire de Houston pour la lecture critique du manuscrit. La recherche est soutenue par le National Institutes of Health (GM083999) attribué à DWH

1. Ablation chirurgicale du tissu Ovaire <ol class="lalpha"><li> Préparer un nouveau lot de milieu de culture des ovocytes (OCM; Matériaux), entre 400 à 800 ml selon la taille de l&#39;expérience. Ajuster le pH de 07.06 à 07.08, jusqu&#39;à ce que le rouge de phénol vire au rouge foncé (six ou si de petites gouttes de NaOH 5N). Verser une petite quantité de vérifier le pH dans un tube séparé depuis l&#39;électrode pH peut contaminer les médias. OCM doit être conservé à 18 ° C et utilisée dans une semaine. </li><li> Sélectionnez 3-5 femelles et placer une solution dans ~ 2L anesthésie tamponnée (Matériaux). Nous essayons d&#39;éviter d&#39;utiliser des grenouilles qui ont été nourris sur le jour de ou avant la chirurgie. Alors que la grenouille est de succomber à l&#39;anesthésie, désinfecter la zone chirurgicale avec EtOH 70% et de préparer les instruments chirurgicaux. </li><li> Stériliser les instruments chirurgicaux de 20 secondes d&#39;immersion dans un stérilisateur à billes chaude à 250 ° C. Les instruments suivants doivent être à portée de main: poignée de scalpel (# 3) et la lame (n ° 10 ou 11), plusieurs paires de Dumont forceps, ciseaux à iris de Bonn (courbe ou droite), Halsey et Olsen Hegar porte-aiguille micro, et les sutures. Placez instruments stérilisés sur une boîte de Pétri stérile ou à l&#39;intérieur de l&#39;emballage de suture pour maintenir stérile. Saisir l&#39;aiguille dans le porte-aiguille dans l&#39;orientation désirée avant de commencer. Nous préférons porte-aiguilles Olsen Hegar depuis la poignée contient des lames de ciseaux, ce qui peut être utilisé pour couper des sutures sans instruments de commutation. </li><li> Après 10 minutes, vérifier que le plan chirurgical de l&#39;anesthésie a été réalisée. Grenouilles anesthésiés vont arrêter de bouger et de ne pas répondre à un pincement de l&#39;orteil ou d&#39;être remis. L&#39;anesthésie devrait durer 15 minutes, ce qui est plus que suffisamment de temps pour effectuer les opérations. Don tenue appropriée chirurgicale. Cela peut inclure des gants propres (sans latex), sarraus et masques chirurgicaux, en fonction des préférences personnelles et institutionnelles des lignes directrices de soins aux animaux. </li><li> Note sur la technique aseptique: sécrétions de la peau grenouille contiennent des peptides antimicrobiens que, généralement, de réduire l&#39;incidence de la contamination pendant la chirurgie, bien que technique aseptique doit être suivie autant que possible. Champs chirurgicaux peuvent être utilisés, mais ne peut être exigé par les IACUC institutionnels et peut ne pas fournir beaucoup d&#39;avantages. Généralement «technique astuce» utilisée, où les mains ne touchent les astuces du matériel stérile, les instruments de suture, ou le site d&#39;incision. Les instruments peuvent être stérilisés à nouveau (dans le stérilisateur billes) incision suivants de la peau, et une zone stérile doivent être maintenus sur la paillasse pour les instruments de placement (comme une boîte de Pétri ou forfait de suture). Les exigences institutionnelles peuvent différer de façon significative, alors s&#39;il vous plaît suivre les directives de votre institution et de recevoir une instruction appropriée avant d&#39;effectuer la chirurgie. </li><li> Retirez la grenouille de l&#39;anesthésie et le lieu en décubitus dorsal sur un linge humide chirurgicale. Remarque. La peau peut être nettoyé par rinçage en iode povidine diluée (1:20) ou la chlorhexidine (0,75%). Cependant, évitez commerciales lavages chirurgicaux, des savons et 70% d&#39;alcool isopropylique, car ceux-ci endommagent la peau délicate des amphibiens. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un scalpel ou des ciseaux petits iris, faire un petit (1 - 1,5 cm) incision dans la peau dans la partie inférieure de l&#39;abdomen, latérale à la ligne médiane. Incisions ultérieures sur la même grenouille doivent être effectués sur les côtés de remplacement, bien espacés les uns des autres. Les incisions peuvent être faites soit parallèle ou perpendiculaire à la ligne médiane. </li><li> Faire des incisions de la peau et des muscles abdominaux en deux étapes. Après avoir coupé la peau, lever la couche musculaire et entourant de couleur blanche fascia avec des pinces et faire l&#39;incision dans le muscle soulevées. Utilisez des ciseaux et couper vers le bas, essayer de faire une coupe rapide pour exposer la cavité du corps laissant bords de la plaie propre. Si tout le fascia est coupé, il se rétracte et se faire des points de suture plus difficile. Lifting du muscle aidera à éviter par inadvertance en blessant un quelconque des organes internes. Aussi, essayez d&#39;éviter de couper à travers des cœurs lymphatiques visibles ou des vaisseaux sanguins dans les couches musculaires. Prolonger la durée avec des ciseaux de l&#39;incision de telle sorte que l&#39;ovaire peut être facilement tiré à travers. </li><li> Ovaire doivent être clairement visibles une fois l&#39;incision est faite. Pour se procurer de l&#39;ovaire, saisir avec une pince et d&#39;externaliser le tissu ovarien. La quantité désirée de tissu est prélevé, et parés à l&#39;arrêt au niveau de la paroi du corps. Ne pas bourrer les tissus dans la cavité coelomique, comme cela pourrait être une source d&#39;infection ou d&#39;autres complications. </li><li> Immédiatement observer un petit morceau d&#39;ovaire sous un microscope à dissection et defolliculate une ovocytes quelques pour tester leur qualité. Ils doivent être fermes et de taille uniforme et la coloration. Si elles sont acceptables, retirer la quantité désirée de tissu de l&#39;ovaire et de suture de l&#39;incision. Assez pour remplir une boîte de Petri de 90 mm est généralement suffisant pour la plupart des expériences. Si les ovocytes sont de qualité douteuse, suture de la grenouille et répéter avec une femme différente. </li><li> Fermer l&#39;incision par une suture du muscle et la couche de fascia premier. Insérez le n<html> Eedle quelques millimètres à l&#39;incision latérale, en veillant à passer à travers la couche aponévrose ainsi. Sutures simplement à travers le muscle peut se déchirer le tissu et se détacher. Utilisez une pince pour aider à insérer l&#39;aiguille en bas sur le côté opposé de l&#39;incision. Libération et re-saisir les aiguilles de l&#39;extérieur du corps et de tirer la suture à travers plusieurs pouces jusqu&#39;au environ de la queue reste, en prenant soin de ne pas tirer tout le long. </li><li> Fermez la plaie avec un modèle simple de suture interrompue. Nous utilisons une cravate instrument de base pour faire des noeuds carrés chirurgien (noeuds récif). Boucle de la longue fin de la suture autour du porte-aiguille, saisir la queue et le passer dans la boucle vers vous et serrez. Boucle et tirez à travers, cette fois tirer le porte-aiguille loin de vous. Un jet de tiers peuvent être utilisés pour plus de sécurité (dans la même direction que le premier). Garniture de la suture, laissant la queue courte et faire une autre de suture dans le muscle à quelques millimètres. Deux sutures sont suffisantes pour les sutures petits, trois pour les grandes. Répétez l&#39;opération pour la couche de peau. Démonstrations vidéo de technique de suture de base sont disponibles sur YouTube - Recherche de &quot;cravate instrument», il ya un assez grand nombre de choix, bien que la technique de base est la même. </li><li> Rincez la femelle avec de l&#39;eau déminéralisée et sa place dans un seau rempli de récupération fraîche (18 ° C) d&#39;eau. Alors que dans le laboratoire, les grenouilles sont conservés dans l&#39;eau du robinet traitée avec Amquel d&#39;éliminer les chloramines. Toutes les quelques minutes, soulevez doucement la grenouille dans l&#39;eau et chercher avalant ou oeil-bombé mouvements, indicatif de récupération de l&#39;anesthésie. </li><li> Remarque: la chirurgie de survie n&#39;est pas strictement nécessaire pour obtenir des tissus ovaire, bien que les femelles vont continuer à produire des ovocytes bon après un certain nombre d&#39;opérations. Effectuer une chirurgie de survie seront également réduire le nombre d&#39;animaux utilisés. Soyez sûr de suivre les directives de votre unité de soins aux animaux vertébrés sur la chirurgie des méthodes de survie, soins postopératoires et le suivi et pour le nombre de chirurgies a permis à un individu. </li></ol> 2. La culture et les ovocytes Defolliculating <ol class="lalpha"><li> Juste après l&#39;intervention chirurgicale est terminée, subdiviser l&#39;ovaire en petits morceaux (~ 2 cm 2) et stocker dans l&#39;OCM frais, en utilisant 5-6 morceaux par 90 mm ​​plat. Lobes individuels de l&#39;ovaire sont à ciel ouvert, aplatie et coupée en morceaux carrés. Ce sont rincés à l&#39;OCM propre et placés dans des boîtes de culture. Aplatissement et divisant l&#39;ovaire va prolonger sa vie dans la culture et de faire defolliculation facile. </li><li> Déplacer un lobe d&#39;un petit plat d&#39;OCM et manuellement defolliculate 300-500 ovocytes. Ovocytes transfert en utilisant une solution stérile, polie au feu pipette. Nous avons trouvé que l&#39;utilisation de la variété de coton-branchée est essentiel pour minimiser la contamination des cultures. Stocker les ovocytes à 18 ° C dans 8 ml OCM (dans les plats de support (Falcon 1007)) dans les groupes de 100-150. Avec la pratique, vous devriez être en mesure de defolliculate ovocytes assez en 1-2 heures. Ovocytes Collagenased ne sont pas appropriés pour le transfert de l&#39;hôte, car ils sont pas fécondables. </li><li> Defolliculating méthode. Nous defolliculate utilisant des horlogers pince (Dumont # ou # 4s 5s, Outils Fine Science), en suivant les méthodes de base décrit dans Smith et al., (1991). En utilisant une paire de pinces (dans votre main dominante), saisir la couche thèque tissu conjonctif qui entoure un ovocyte entièrement développé stade VI près du lieu où le follicule est attaché à l&#39;ovaire (la tige). Avec l&#39;autre paire de pince, saisir l&#39;ovaire adjacent à la première paire. Légèrement déchirer la couche folliculaire en tirant dans l&#39;ovocyte. Doucement taquiner l&#39;ovocyte hors du tissu. Ovocytes avec succès defolliculated sont floppier que ovocytes tout simplement retiré sans enlever la couche de follicule et sera dépourvue de vaisseaux sanguins visibles. </li><li> Note: Il est essentiel de maintenir une pression très légère sur le bout de la pince, à peine suffisant pour les conseils à respecter. Préhension trop serré est une commune parmi les débutants et les entraînera dans l&#39;ovocyte étant arrachée avec le follicule intact. Gardez une bonne paire de pince exclusivement pour defolliculating. Les conseils doivent répondre précisément et devrait être légèrement émoussé à pince pour faire des explants d&#39;embryons de xénope (Figure 1). </li><li> Nous faisons régulièrement tester maturité environ 20 avec de la progestérone et avorter l&#39;expérience si le taux de maturation est faible (&lt;50% après 6-7 heures à température ambiante). </li><li> À ce stade, les ovocytes peuvent être manipulés et cultivé comme vous le souhaitez, telles que la microinjection d&#39;oligo, morpholino ou ARNm. Procédures d&#39;injection varier selon le laboratoire, afin que nous ne décrirons pas ceux qui sont ici. Les ovocytes peuvent être maintenus jusqu&#39;à une semaine dans les OCM, mais généralement, la santé décline donc il est préférable de les utiliser pour le transfert dans les 96 heures d&#39;isolement. </li><li> Gardez à l&#39;esprit que seulement cinq à six groupes (y compris un contrôle) peuvent être transférées à une seule femelle, en raison de restrictions sur les colorants vitaux, afin de planifier vos expériences en conséquence. </li></ol>&quot;&gt; 3. Ovocytes maturation et la stimulation des Femmes hôtes potentiels <ol class="lalpha"><li> Si vous effectuez une opération de sauvetage de l&#39;épuisement des oligo, injecter votre ARNm (généralement de 50 à 300 pg d&#39;ARN) ~ 24-48 heures après l&#39;oligo. Les oligos aura dégradé par ce temps et ne devrait pas affecter l&#39;ARN injecté. </li><li> Le soir avant d&#39;effectuer le transfert, ajouter 16 ul de solution de progestérone de travail (1 mM dans EtOH) pour ovocytes dans 8 ml OCM dans les plats de moyenne (concentration de progestérone final est ~ 2 M). Incuber 10-12 heures à 18 ° C pour permettre la maturation ovocytaire. </li><li> Injecter 3-5 femelles avec 1000 unités par grenouille d&#39;hCG pour induire la ponte. Nos expériences semblent fonctionner mieux si la maturation ovocytaire et l&#39;injection d&#39;hCG sont faites à la même époque, environ 12 heures avant l&#39;implantation dans l&#39;hôte (par exemple, 22 heures -10 heures). Laisser les femmes à la température ambiante ou à 18 ° C pendant la nuit. </li></ol> 4. Préparation et coloration des ovocytes colorant vital <ol class="lalpha"><li> Dans la matinée du transfert, permettent ~ 45-60 &#39;à configurer et effectuer la procédure. À ce stade, les ovocytes matures peuvent être congelés pour une analyse ultérieure de l&#39;efficacité de knockdown ARNm ou d&#39;expression de protéines. Aussi, vérifiez que les ovocytes ne sont pas devenus infectés et qu&#39;il y avait un taux de maturation bonne (&gt; 50%). Ovocytes infecté ne sera pas fertiliser. Dégel des colorants vitaux (Matériaux) et tournent à vitesse max pendant 5 min. </li><li> Couleur des différents groupes expérimentaux en ajoutant 80 pl de la teinture appropriée vitaux (s) pour les plats ovocyte et incuber avec bascule pour 15 &#39;. Pendant ce temps, sélectionnez une femelle hôte et commencer à l&#39;anesthésie. Choisissez une grenouille qui est lentement pondre normalement ou celle qui produit des œufs en abondance avec la compression légère. Oeufs de l&#39;hôte doit être de bonne qualité. Évitez les femelles qui pondent des œufs ou des chaînes d&#39;œufs écrasées. </li><li> Transférer les oeufs colorés dans un grand plat d&#39;OCM frais, tourbillon brièvement pour se laver et les mettre de côté avant le transfert. </li><li> Préparer une pipette Pasteur stérile avec un alésage juste assez large pour accueillir un ovocyte (~ 1,5 mm) pour utilisation dans la transplantation des ovocytes. Score de la pipette avec un crayon de diamants et de briser proprement. Incendie polonaise jusqu&#39;au bords sont lisses, en prenant soin de ne pas fondre l&#39;ouverture fermée. </li></ol> 5. Exécution de la transplantation des ovocytes <ol class="lalpha"><li> La transplantation d&#39;ovocyte utilise les mêmes procédures chirurgicales comme décrit dans la Partie I, bien au lieu d&#39;enlever l&#39;ovaire, les ovocytes manipulés sont introduits dans la cavité du corps avec une pipette. Idéalement, la procédure de transfert doit être effectué aussi rapidement que possible et de la taille de l&#39;incision doit être maintenu aussi petit que possible. </li><li> Anesthesize la femelle hôte et préparer les instruments chirurgicaux tels que décrits dans la partie I. Faire une incision et comme décrit dans la partie I. L&#39;incision peut être plus petite, mais elle doit être assez grand pour accueillir l&#39;alésage de la pipette de transfert (figure 2A). </li><li> Pour transplanter les ovocytes, saisir et d&#39;élever un volet du muscle et du fascia avec une pince et d&#39;introduire les ovocytes expérimentaux utilisant la pipette Pasteur préparé ci-dessus. Swirl le plat d&#39;ovocytes de les recueillir dans le centre et sucer autant que possible. Autoriser les ovocytes de s&#39;installer dans l&#39;extrémité de la pipette pour éviter l&#39;excès de liquide étant introduit et insérer l&#39;extrémité de la pipette dans l&#39;incision et lentement les ovocytes permettent à arriver dans la cavité du corps (figure 2B). Répétez jusqu&#39;à ce que tous les ovocytes ont été transférés. Ne relâchez pas la couche musculaire à tout moment, jusqu&#39;à ce que vous avez commencé à suturer, ou les ovocytes se renverse de l&#39;incision. </li><li> Une fois les ovocytes ont été transférés, saisir des deux côtés de l&#39;incision avec une pince et de les rassembler, les ovocytes permettant de s&#39;installer dans la cavité du corps. Commencez suture tel que décrit, en prenant soin de maintenir la tension à la hausse sur le muscle et le fascia jusqu&#39;au premier noeud est lié (figure 2C). Cela permet de garder les ovocytes d&#39;être expulsé et permettra aux bords de l&#39;incision à guérir de façon égale. Ajouter un autre de suture dans la couche musculaire / fascia puis suturer la peau. </li><li> Rincez la femelle avec de l&#39;eau déminéralisée et sa place dans un seau rempli de récupération refroidi (18 ° C) Amquel eau traitée. Surveiller son rétablissement de l&#39;anesthésie comme ci-dessus. Elle devrait commencer à pondre normalement après l&#39;opération. </li><li> Obtenir les testicules d&#39;une grenouille mâle en utilisant des procédures normales. Stocker les testicules chez l&#39;OCM ou L15 jusqu&#39;à ce que nécessaire. Nous préférons testicule frais quand la fertilisation des expériences de transfert. </li></ol> 6. La fécondation des ovocytes et de récupération in vitro <ol class="lalpha"><li> Cils péritonéale va conduire le transfert des oeufs (oeufs et normal cœlomique de l&#39;hôte) pour les ouvertures des oviductes dans la partie antérieure de la cavité du corps. Oeufs colorés peuvent être récupérés commence 2-3 heures après le transfert en serrant la normale. Les œufs peuvent être obtenus à chaque demi-heure ou jusqu&#39;à ce que la femme arrête la ponte. </li><li> Fertiliser dans un SPEsuspension de rm (dans ~ 4 ROR ml 1x) pendant 4 minutes. Flood et rincer abondamment avec ROR 0.1x. Les œufs doivent activer normalement et commence à cliver ~ 1,5 à 2 heures après la fécondation. Transféré oeufs seront souvent cliver un peu plus tard que les œufs hôte. </li><li> Enlevez les couches de gelée à la cystéine comme des embryons normaux et trier dans des boîtes séparées. Cela peut être fait à n&#39;importe quelle étape, selon les besoins de l&#39;expérience. Il est plus facile en général à identifier les différentes couleurs autour du stade de 4 cellules et la plus difficile au cours de derniers stades blastula. Culture des oeufs à faible densité (&lt;50 par plat moyennes) en 0,1 x ROR propre. De ce point, les embryons peuvent être traités et manipulés normalement. </li><li> Retour des grenouilles à l&#39;animalerie et de surveiller en cas de complications au cours des prochains jours. </li><li> Méthode de la fécondation de rechange; ponte dans un tampon de sel <ol class="lroman"><li> Après la grenouille a récupéré de l&#39;anesthésie, sa place dans ~ 1L en sel ROR (1.2x). Laisser la femelle à pondre des oeufs dans le tampon d&#39;environ 4-6 heures. Presser les oeufs restant hors, drain ROR 1.2x et trier les oeufs colorés dans un plat à nettoyer, enlever tout le liquide possible. </li><li> Laver abondamment avec ROR 0.3x et fertiliser au volume minimal de 0.3x MMR / sperme suspension jusqu&#39;à ce que les œufs d&#39;activer (10 minutes). Flood avec ROR 0,1 x et la culture comme ci-dessus. Cette option est utile si de nombreux oeufs sont nécessaires au même stade ou si l&#39;expression manuelle des oeufs endommage le don d&#39;ovocytes. </li></ol></li></ol>

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Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université de l&#39;Iowa IACUC Comité.

Un transfert réussi aboutira à la fécondation et de clivage normal de&gt; 50% des ovocytes (Figure 3). Généralement entre 30-60% des ovocytes transfert va survivre dernières étapes neurula. Nous transfèrent habituellement de 75 à 150 ovocytes par groupe expérimental, ce qui donnera suffisamment d&#39;embryons pour plusieurs types d&#39;analyses (in situ, RT-PCR) ainsi que la visualisation du phénotype. L&#39;implantation d&#39;ovocytes nettement plus ne semble pas augmenter considérablement le rendement. En ...

Solutions et recettes: OCM (milieu de culture des ovocytes; modifiées de Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% Leibovitz milieu L-15 (contenant de la L-glutamine) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA; fraction V) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x pénicilline-streptomycine </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajuster le pH à 7.6 au 7.8 avec NaOH 5N </td></tr><tr><td colspan="2"> Faire frais hebdomadaires, stocker à 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X ROR (Solution de Marc modification de Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> NaCl 1M </td></tr><tr><td> 20 mM de KCl </td></tr><tr><td> 20 mM de CaCl2 </td></tr><tr><td> MgCl2 10 mM </td></tr><tr><td> 150 mM d&#39;HEPES </td></tr><tr><td> ajuster le pH à 7.6 au 7.8 </td></tr><tr><td> Conserver à 4 ° C </td></tr></tbody></table> Une solution d&#39;anesthésique <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzoïque ester éthylique d&#39;acide (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bicarbonate de sodium 0,7 g / L </td></tr><tr><td colspan="2"> Dissoudre dans l&#39;eau traitée Amquel </td></tr><tr><td colspan="2"> Faire frais hebdomadaires </td></tr></tbody></table> Stocks de progestérone <table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM de progestérone (Sigma P-0130) dans l&#39;éthanol à 100% </td></tr><tr><td> Diluer à 1 mM dans EtOH à 100% pour un stock 500x / solution de travail </td></tr><tr><td> Conserver à -20 ° C </td></tr></tbody></table> Colorants vitaux (modifié à partir Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Bleu: 0,1% du Nil Bleu Une </td><td> (Aldrich 121 479-5G), </td></tr><tr><td> Rouge: 0,25% Rouge Neutre </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Vert (80 bleues + 80 ul ul marron), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 ul bleues + 80 rouges ul). </td></tr><tr><td colspan="2"> Une couleur sixième, Orange (80 ul rouges + 80 ul brun), peut également être utilisé mais il est souvent difficile à distinguer de brun. </td></tr></tbody></table> Stocks de bleu, rouge et brun sont constitués dans de l&#39;eau déminéralisée dans des tubes de 50 ml, incubée pendant 20 minutes avec bascule et filé dans une centrifugeuse clinique. Les surnageants sont aliquotes dans des tubes de centrifugeuse et conservés à -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Etudier l&#39;apport de molécules hérité de la mère au développement précoce des vertébrés est souvent entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour produire des animaux mutants à effet maternel. De plus, de nombreuses techniques pour surexprimer ou inhiber la fonction des gènes dans des organismes comme le poisson-zèbre et le xénope ne parviennent pas à suffisamment cible critique maternelle voies de signalisation, tels que la signalisation Wnt. Chez le xénope, la manipulation de la fonction des gènes dans les ovocytes en culture et par la suite les fertiliser peut améliorer ces problèmes dans une certaine mesure. Les ovocytes sont manuellement defolliculated à partir de tissus d&#39;ovaire donateurs, injecté ou traité dans la culture comme souhaité, et ensuite stimulées avec de la progestérone pour induire la maturation. Ensuite, les ovocytes sont introduits dans la cavité du corps d&#39;une grenouille hôte ovulation féminine, après quoi ils seront transporté dans l&#39;oviducte de l&#39;hôte et l&#39;acquisition des modifications et des manteaux de gelée nécessaires à la fécondation. Les embryons ainsi obtenus peuvent ensuite être porté à la scène désirée et analysées pour les effets de toute perturbations expérimentales. Cette méthode de transfert de l&#39;hôte a été très efficace dans la découverte des mécanismes de base du développement précoce et permet un large éventail de possibilités expérimentales ne sont pas disponibles dans tous les autres vertébrés organisme modèle.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procédure pour la fertilisation<em&gt; Ovocytes de Xenopus</em&gt; Par la méthode de transmission de l&#39;hôte.

La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d&#39;hôte

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

14.5K vues.  University of Iowa. Procédure pour la fertilisation Ovocytes de Xenopus Par la méthode de transmission de l'hôte.

Vidéo: Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transfert nucléaire dans des ovocytes de la souris

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Recherche

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualisation de localisation de l&#39;ARN Xenopus Les ovocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Etude de l&#39;ADN à l&#39;aide de Checkpoint dommages<em&gt; Xenopus</emExtraits d&#39;oeufs&gt;

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Mesure de transport de cations Na, K et H, K-ATPase dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Les ovocytes par spectrophotométrie d&#39;absorption atomique: une alternative à dosages radio-isotopes

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...