L’édition des gènes CRISPR/Cas9 chez les poissons faiblement électriques, en particulier dans un contexte comparatif, permettra aux chercheurs de tester des hypothèses sur la façon dont des gènes spécifiques et la variance génétique contribuent à la variation phénotypique. CRISPR/Cas9 est une méthode efficace pour générer des embryons mutants F-zéro. Ce protocole permet aux chercheurs d’effectuer des manipulations CRISPR-Cas9 chez deux espèces convergentement évoluées de poissons faiblement électriques.
La clé de l’utilisation de cette approche avec quelques modifications chez d’autres poissons électriques ou d’autres espèces de poissons est la disponibilité de ressources transcriptomiques ou génomiques pour fabriquer des SGARN. Il peut être difficile d’effectuer les microinjections et de visualiser les cellules dans un emplacement 3D à l’intérieur d’un plan 2D. Obtenez une petite colonie de poissons zèbres pour que les œufs pratiquent des techniques générales de microinjection.
Jared Thompson, technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec Savvas Constantinou. Après avoir abrité les espèces de poissons d’intérêt dans les conditions de reproduction appropriées, identifier les poissons femelles qui semblent gravid. Dans B.gauderio, la femelle aura des 9ades gonflées juste caudales à l’évent.
Chez B.brachyistius, les femelles auront le ventre gonflé et semblent corsées. Après l’administration d’anesthésie, ajouter l’agent de frai à quatre fois le volume de DPBS dans un tube PCR avec un mélange complet. La solution deviendra trouble.
Utilisez une pipette pour mesurer la dose calculée et distribuer l’agent dilué à un morceau de thermoplastique avant de dessiner la solution dans une seringue en verre de précision équipée d’une aiguille biseauté de 28 calibres de 19 à 25 millilitres. Injecter la solution dans le muscle du tronc dorsal à un rythme lisse et laisser reposer l’aiguille pendant deux à quatre secondes avant l’enlèvement. Ensuite, placez immédiatement le poisson dans l’eau du système frais pour la récupération.
Pour la collecte de sperme B.gauderio, après 24 heures, sélectionnez un gros poisson mâle et aussi rapidement que possible après la sédation, séchez soigneusement le poisson, en particulier autour de la tête et de l’évent. Placez le côté ventral de poisson séché vers le haut, antérieur vers la gauche dans le support approprié, couvert d’une serviette en papier humide trempée MS222 avec la tête aussi parallèle que possible à la table. Appliquez immédiatement une pression dans la direction caudale à rostrale avec une légère compression immédiatement sur les 9ades vers l’évent et à l’aide d’un micropipetter avec une pointe, recueillir soigneusement le sperme car il est pressé du mâle par incréments de 50 microlitres.
Ajouter aliquot de sperme directement sur des volumes de 500 microlitres de solution d’extension de sperme sur la glace. Immédiatement après la collecte, placer le poisson dans de l’eau du système frais traitée par le produit de protection contre la boue. Pour la collecte d’oeufs B.gauderio, après séchage d’un poisson femelle anesthésié B.gauderio, placez immédiatement le poisson sur le côté avec la tête face à la main non dominante et appliquez une pression dans la direction caudale à rostrale avec une légère compression médiocre sur les 9ds vers l’évent.
À l’aide d’un outil en polytétrafluoroéthylène, recueillir soigneusement les œufs lorsqu’ils sont pressés du cloaque et placer rapidement les œufs dans une petite boîte de Pétri couverte. Si vous travaillez seul après avoir compressionné, touchez la masse d’œufs à la base de la petite boîte de Pétri lorsqu’ils sont expulsés de la femelle. Immédiatement après la collecte des œufs, placez le poisson dans de l’eau du système frais traitée par le produit de protection contre la boue.
Pour la fécondation in vitro B.gauderio, ajouter 100 microlitres de la solution ses sperme bien mélangé directement sur la masse d’ovule, suivie d’un millilitre d’eau du système frais. Mélanger soigneusement la suspension des gamètes pendant 30 à 60 secondes avant d’ajouter un à deux millilitres supplémentaires d’eau de système filtrée par pore de 0,22 micromètre aux cellules. Étiquetez le plat avec le temps de fécondation in vitro et placez le plat dans un incubateur de 29 degrés Celsius, en fixant une minuterie de 50 minutes pour vérifier l’état d’avancement du développement.
Pendant la période de fertilisation, utilisez une pointe de pipette microchargeur pour recharger deux microlitres de la solution d’injection d’intérêt dans une aiguille de microinjection et expulser le liquide le plus près possible de la pointe. Lorsqu’une seule cellule s’est formée au pôle animal d’au moins une cellule, transférez le plat sous un microscope disséquant et utilisez une paire de forceps fins pour briser la pointe de l’aiguille à un angle biseauté vers l’endroit où le cône de l’aiguille commence à démontrer la rigidité. L’alésage de l’aiguille doit rester aussi petit que possible tout en maintenant un cône rigide.
Identifiez les zygotes en développement au microscope et utilisez une pipette de transfert en plastique avec une pointe coupée pour placer 10 à 20 œufs dans le moins d’eau possible sur le bord de la lame de microscope en verre fixée dans le dessus inversé de la boîte de Pétri. À l’aide d’un chiffon de tâche délicat, appuyez doucement sur la lame pour enlever l’excès d’eau pour permettre aux œufs d’adhérer fermement au bord de la lame. L’eau sera méchante sous la lame et tirera des oeufs contre le bord.
Il devrait y avoir juste assez d’eau pour garder les oeufs humides tout en maintenant peu d’humidité debout pour éviter le mouvement d’oeuf pendant l’injection. Alignez les œufs contre la glissière verticalement, perpendiculairement à l’aiguille qui approche, et utilisez un micromanipulateur pour positionner l’aiguille contre la chorion. Ensuite, en tenant l’aiguille à un angle d’environ 45 degrés, insérez d’abord la pointe dans la chorion, puis, dans la cellule unique, en injectant par le jaune si possible.
Retirer les œufs cassés pendant l’injection avec des forceps fins. Lorsque tous les œufs ont été injectés, utilisez une bouteille de gicler de 0,22 micromètre d’eau filtrée du système pour rincer doucement les œufs du stade d’injection dans une nouvelle boîte petri de 100 millimètres de diamètre. À la suite d’un court guide réussi de sélection et de synthèse des ARN, le clivage in vitro peut être testé pour la sélection des microinjections à cellules simples.
Après le nettoyage et le clonage de PCR, dans cette expérience représentative, des mutations induites crispr-cas9 ont été identifiées dans les clones individuels de B.gauderio et de B.brachyistius avec la réduction forte d’amplitude électrique de décharge d’organe, alors que les contrôles non injectés ont montré seulement les génotypes référencés. La visualisation de l’amplitude de décharge d’organe électrique entre les mutants confirmés de CRISPR et la taille d’agent a assorti des contrôles non injectés a démontré que les embryons mutants de B.brachyistius et de B.gauderio de SCN-4 AA ont eu des amplitudes significativement inférieures de décharge d’organe électrique que des contrôles. Lors de l’exécution des micro-injections, déplacez-vous aussi rapidement et délibérément que possible pour maximiser le nombre d’embryons injectés à une cellule qui survivent.
Ne perdez pas de temps avec des œufs difficiles. Une fois que les mutants réussis ont été identifiés, les méthodes de reproduction traditionnelles peuvent créer des lignées mutantes stables, qui éliminent les préoccupations de mosaicism associées au CRSPR. Ce protocole permettra aux chercheurs de mener des études génomiques comparatives avec validation fonctionnelle chez deux espèces convergentement évoluées de poissons faiblement électriques.
