Récolte, décellularisation et digestion de la pepsine des tissus pulmonaires bovins pour la formation d’hydrogel de matrice extracellulaire pulmonaire décellularisée

1 Pour commencer, retirez les tissus pulmonaires bovinscongelés 2 à 80 degrés Celsius 3 et laissez-les décongeler à température ambiante. 4 Disséquez le tissu à l’aide de scalpels stériles et de ciseaux 5 pour retirer la trachée et les voies respiratoires cartilagineuses, 6 puis mentez le tissu en petits morceaux. 7 Lavez le tissu trois fois 8 avec de l’eau ultra-pure 9 contenant 2% de pénicilline et de streptomycine.

10 Immerger l’échantillon de tissu haché 11 dans une solution d’iode à 2 % pendant une minute, 12 puis effectuer deux lavages consécutifs 13 dans de l’eau distillée stérile. 14 Transférez les morceaux de tissu dans un tube de 50 millilitres 15 jusqu’au repère de 15 millilitres. 16 Remplissez le tube jusqu’en haut avec de l’eau distillée 17 et congelez-le dans de l’azote liquide pendant deux minutes.

18 Ensuite, transférez immédiatement le tube dans un bécher 19 contenant de l’eau à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. 20 Après cinq cycles de congélation et de décongélation, 21 incuber l’échantillon dans 30 millilitres 22 de solution de DNase pendant une heure 23 à 37 degrés Celsius en agitant constamment. 24 Congelez les échantillons de matrice extracellulaire décellularisée humide 25 à 80 degrés Celsius pendant 24 heures.

26 Transférez les échantillons congelés dans un lyophilisateur 27 et faites-les fonctionner en mode séchage sous vide 28 pendant trois à quatre jours jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. 29 Après la lyophilisation, 30 broyer les échantillons en une poudre fine 31 dans un appareil de broyage contenant de la glace sèche. 32 Traitez les tissus pulmonaires avec 1% de Triton-X-100 33 pendant trois jours sous une rotation douce 34 à quatre degrés Celsius, 35 en changeant la solution toutes les 24 heures.

36 Incuber l’échantillon dans la solution de DNase 37 pendant une heure à 37 degrés Celsius en agitant constamment. 38 Lavez le mouchoir à l’eau distillée 39 pendant trois jours en roulant constamment, 40 en réapprovisionnant l’eau toutes les 24 heures. 41 Après le dernier lavage, effectuer la lyophilisation et le cryobroyage 42 comme démontré précédemment.

43 Digérer 15 milligrammes par millilitre 44 échantillons de matrice extracellulaire décellularisée en poudre 45 dans une solution de pepsine d’un milligramme par millilitre 46 à température ambiante sous agitation constante pendant 48 heures. 47 Maintenez le pH de la solution à deux pour une digestion efficace. 48 Centrifuger le tissu à 5 000 g pendant 10 minutes 49 et retirer le surnageant.