Notre protocole est important car il permet la création de maladies dans des hydrogels qui ressemblent beaucoup à la nature du tissu cartilagineux. Le principal avantage de cette technique est la capacité de produire des maladies dans des hydrogels avec une activité biologique évidente dans la structure spatiale, une faible immunogénicité et une fonction industrielle biologique. Pour commencer, hachez le cartilage collecté à l’aide d’un scalpel en morceaux d’un à deux millimètres cubes.
Dans un tube à centrifuger de 50 millimètres, immergez 20 grammes de cartilage haché dans 20 millilitres de tampon hypotonique de chlorhydrate de Tris. Placez le tube à 80 degrés Celsius pendant trois heures, puis au four à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Faites tourner le tube à centrifuger pendant 30 secondes à 1000 tr/min.
Filtrez ensuite le cartilage décellularisé à l’aide d’un tamis en plastique placé sur un tube à centrifuger de 50 millilitres. Lavez le cartilage trois fois avec du PBS stérile avant de le prélever. Ajoutez 10 millilitres de solution de trypsine au cartilage collecté et incubez-le sur un agitateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, en remplaçant la trypsine toutes les quatre heures.
Après avoir filtré la suspension, lavez le cartilage trypsinisé avec un tampon hypertonique. Une fois le cartilage préservé, ajoutez 10 millilitres de solution de nucléase et placez-le sur un shaker à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Après le lavage avec du PBS stérile, ajoutez une solution hypertonique de chlorhydrate de Tris au cartilage et placez-la sur le shaker comme démontré.
Une fois lavé avec du PBS stérile, immergez le tissu dans une solution à 1 % de Triton X-100 pendant 24 heures. Après avoir retiré le Triton X-100, rincez le cartilage décellularisé avec de l’eau distillée pendant trois jours, en changeant l’eau toutes les 12 heures. Après trois jours, ajoutez une solution d’acide peracétique au cartilage et faites-le tremper pendant quatre heures.
Une fois lavé avec du PBS, collectez le cartilage à l’aide d’un tamis en plastique comme démontré précédemment. À l’aide d’azote liquide, préparez de la poudre de cartilage décellularisé. Ajoutez 80 millilitres d’acide acétique à 0,5 molaire et 20 milligrammes de pepsine à deux grammes de poudre de cartilage et digérez le mélange pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.
Après la digestion, centrifugez la suspension à 400 G pendant 10 minutes et récupérez le surnageant, qui est maintenant appelé solution DC-ECM Pour stocker la solution DC-ECM, ajoutez un millilitre de solution dans chaque puits d’une plaque à six puits et placez-la dans un lyophilisateur. Une fois la solution lyophilisée, transférez-la dans un tube à centrifuger. Pour former un hydrogel, dissoudre 20 milligrammes de solution DC-ECM lyophilisée dans un millilitre d’eau distillée stérile.
Une fois le vortex effectué, ajoutez un milligramme de vitamine B2 à la solution DC-ECM. Après incubation, irradiez-le avec une lumière UV pendant trois minutes. Ajouter le tampon GTL et la protéinase K à 20 milligrammes de poudre de cartilage DC-ECM et bien mélanger en utilisant l’oscillation vortex.
Pour une dissolution complète du cartilage, incubez le mélange à 56 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois le vortex, ajoutez 200 microlitres de tampon GTL suivi d’éthanol anhydre. Après le vortex, centrifugez l’échantillon à 6000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius.
Ensuite, collectez et quantifiez l’ADN comme décrit dans le manuscrit. Pour analyser le collagène, acidifiez cinq milligrammes de poudre DC-ECM dans de l’acide chlorhydrique à 100 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, neutralisez-le avec cinq millilitres de solution d’hydroxyde de sodium à six molaires.
Calculer la teneur en hydroxyproline de l’échantillon neutralisé en utilisant l’absorbance à 570 nanomètres par rapport à l’étalon d’hydroxyproline. Ajouter 500 microlitres de réactif A à 200 milligrammes de poudre DC-ECM après mélange. Incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 16 heures.
Une fois centrifugé, prélever 50 microlitres de solution d’échantillon et ajouter 50 microlitres de réactif B, puis le réactif C.Après avoir incubé l’échantillon pendant 10 minutes, ajoutez 750 microlitres de réactif D et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après centrifugation, ajoutez un microlitre de réactif E à la pastille et mélangez bien avant de centrifuger. Dissociez ensuite l’échantillon avant la mesure de la teneur en GAG.
Dans le cartilage DC-ECM préparé, le contenu en ADN a été éliminé de manière significative. Cependant, la teneur en collagène et en GAG a été conservée par rapport au cartilage natif. L’analyse MEB et MET a démontré l’ultrastructure de la DC-ECM préparée.
L’hydrogel préparé dans le tube inversé ne s’est pas écoulé vers le fond, ce qui a démontré une gélification. De plus, par rapport à la solution DC-ECM seule, l’ajout de vitamine B2 a réduit le temps de gélification en raison de la réticulation induite lors de la formation de l’hydrogel DC-ECM. La viscosité de l’hydrogel DC-ECM était supérieure à la viscosité de la solution et l’augmentation des taux de cisaillement a diminué la viscosité de la solution.
De plus, le module de stockage élevé de la solution DC-ECM et de l’hydrogel indiquait qu’ils avaient tous deux des propriétés de gel plutôt que de liquide. L’analyse MEB a démontré que la taille des pores de la solution DC-ECM était significativement diminuée sous forme d’hydrogel après réticulation et lyophilisation. Le protocole implique une combinaison de perturbation physique et chimique et de digestion enzymatique pour éliminer le matériel cellulaire tout en préservant la structure et la conversation de l’ECM.
