Ce protocole permet l’utilisation reproductible de la matrice extracellulaire pulmonaire intacte comme substrat de culture tissulaire tridimensionnelle et à débit modéré. Le principal avantage du système de tissu pulmonaire artificiel est la flexibilité de la plate-forme. Les ELT peuvent être adaptées pour utiliser divers échafaudages tissulaires, cellules ou milieux de culture d’intérêt.
Une fois les poumons extraits, remplissez une seringue de 10 millilitres avec de l’agarose et du HBSS sans rouge phénol. Gonfler les poumons avec environ 10 millilitres d’air via la canule de la trachée, puis injecter immédiatement l’agarose préparée via la canule de la trachée jusqu’à ce que les extrémités les plus distales des lobes pulmonaires soient gonflées. Coiffez la trachée en attachant le capuchon blanc d’un robinet d’arrêt à quatre voies à la serrure femelle de la canule trachéale.
Placez le poumon dans une boîte de Petri de 150 millimètres sur de la glace pour permettre à l’agarose de se solidifier. Préparez les tranches de poumon selon le protocole du manuscrit, puis remplissez une boîte de Petri de 100 millimètres avec 1/3 de volume de PBS. Transférez les cassettes et les languettes dans le plat à l’aide de pinces.
Si les tranches sont congelées, décongeler un plat à la fois en versant sur du PBS à température ambiante. Ensuite, transférez une tranche décongelée dans une boîte de Petri de 150 millimètres. Déplier doucement la tranche à l’aide d’une pince fine ou d’un hémostat et aspirer soigneusement l’excès de PBS autour du tissu.
Ensuite, coupez une bande de trois millimètres de large et d’au moins neuf millimètres de long de la tranche en appuyant fermement sur toute la longueur d’une lame de rasoir contre le plat et en le berçant légèrement d’un côté à l’autre. Pour clipser la bande de tissu dans la cassette, faites-la flotter au-dessus de la cassette, en la centrant soigneusement pour l’étendre au-delà des trous dans les clips à chaque extrémité. Placez une languette en partie dans le trou à une extrémité avec une pince fine, redressez doucement le tissu et réglez la deuxième languette.
Enfin, utilisez des pinces pour appuyer complètement sur chaque languette afin de sécuriser le tissu. Après avoir coupé tous les côtés, transférez la parabole de 100 millimètres contenant les cassettes dans une hotte à flux laminaire. Transférez les cassettes sur des plaques à six puits contenant la première solution de décellularisation à l’aide d’un hémostat incurvé pour saisir les côtés entaillés.
Ensuite, placez la plaque à six puits sur un agitateur orbital à 30 tr / min pendant 10 minutes. Aspirer le liquide de chaque puits, puis le remplacer par trois millilitres de la deuxième solution de décellularisation par puits. Placez la plaque sur un agitateur orbital à 30 tr/min et incubez pendant cinq minutes.
Répétez ce processus avec chaque solution comme indiqué dans le protocole de décellularisation du manuscrit. Après le rinçage final avec du PBS, transférer les tissus dans des plaques stériles à six puits contenant du PBS frais avec des antibiotiques et des antimycotiques et incuber à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Après la stérilisation avec des antibiotiques et des antimycotiques, les échafaudages de tissus pulmonaires peuvent être ensemencés immédiatement ou stockés à quatre degrés Celsius pendant 30 jours.
Avant de les utiliser pour la culture, incuber des échafaudages stockés à quatre degrés Celsius avec du PBS frais et des antibiotiques et antimycotiques pendant la nuit à 37 degrés Celsius comme étape de stérilisation supplémentaire. Ensuite, rincez les échafaudages avec du PBS stérile, cinq millilitres par puits, trois fois, pendant cinq minutes chacun. Examinez les échafaudages sous un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 5X pour sélectionner les tissus à ensemencer.
Préparer la suspension de cellules endothéliales en milieu endothélial à 5 millions de cellules par millilitre avec suffisamment de cellules pour ensemencer 500 000 cellules endothéliales par tranche. Placez les bains de semis autoclavés dans des boîtes de Petri de 100 millimètres et transférez soigneusement les échafaudages de rinçage à l’envers dans les bains de semis. Faites tourbillonner doucement la suspension cellulaire préparée pour mélanger.
Ensuite, pipetez soigneusement 100 microlitres de cellules directement sur chaque tissu à la base des puits, en prenant soin de ne pas endommager le tissu avec la pointe de la pipette. Transférer les tissus ensemencés dans l’incubateur de culture cellulaire. 24 heures après l’ensemencement des cellules endothéliales, ajouter 900 microlitres de milieu de culture préchauffé à chaque puits à l’aide d’une pipette manuelle, puis remettre la plaque à l’incubateur.
Après 24 heures d’ensemencement cellulaire, retirez le milieu et remplacez le millilitre de milieu endothélial frais par puits. 72 heures après l’ensemencement des cellules endothéliales, comptez les cellules AEC2 ou épithéliales alvéolaires de type II, et les fibroblastes à l’aide d’un hémocytomètre et préparez une suspension cellulaire 1:1 dans un milieu de croissance AEC2 à 5 millions de cellules par millilitre. Pipettez bien le milieu de chaque bain d’ensemencement et faites tourbillonner doucement la suspension cellulaire préparée.
Pipette 100 microlitres de cellules directement sur chaque tissu à la base du puits. Transférer les tissus ensemencés dans l’incubateur de culture cellulaire. Après deux heures, ajoutez 900 microlitres de milieu de croissance AEC2 préchauffé à chaque puits, puis retournez la plaque à l’incubateur.
Après 24 heures de culture avec des AEC2 et des fibroblastes, préparer une plaque de 12 puits avec un millilitre de milieu de croissance AEC2 préchauffé par puits, par cassette. Pipette 800 microlitres de milieu de chaque puits du bain d’ensemencement, puis retirez les cassettes du bain d’ensemencement et transférez-les du côté droit vers la plaque préparée de 12 puits, une cassette par puits. Changez soigneusement le milieu de culture à l’aide d’une pipette Pasteur en verre tous les deux jours pendant la durée de culture souhaitée.
Surveillez le degré de repeuplement des tissus par microscopie à contraste de phase à un grossissement de 5X pendant toute la durée de la culture. La coloration H et E des échafaudages tissulaires a montré une architecture alvéolaire préservée après décellularisation sans noyaux cellulaires visibles. Le tissu alvéolaire a été observé lorsque des échafaudages de matrice extracellulaire décellularisés ont été vus à un grossissement de 5X par microscopie à contraste de phase.
De grandes voies respiratoires et des navires ramifiés étaient également visibles dans certaines tranches. Le septième jour de la culture, la microscopie à contraste de phase a montré que le modèle de recellularisation dans les tissus pulmonaires modifiés émulait la structure alvéolaire des tissus en cas de repeuplement réussi. Une mauvaise recellularisation était également visible.
La coloration H et E le septième ou le huitième jour a montré un repeuplement des septa alvéolaires. L’immunofluorescence debout a révélé des fibroblastes pro-collagène de type I alpha 1 positifs, des AEC2 ABCA3 positifs, des cellules endothéliales CD31 positives et des AEC2 positifs SPB abondants. De plus, le test de thymidine a montré de nombreuses proliférations d’AEC2.
Cette technique a facilité le développement de stratégies pour l’ingénierie des tissus pulmonaires et a permis des recherches dans les files d’attente soutenant la prolifération et la différenciation des cellules de type II au sein de l’alvéole.
