Ce protocole démontrera la mise en œuvre et l’optimisation de la microscopie SRS à focalisation spectrale et comment elle peut être utilisée pour des applications d’histologie Raman stimulées en temps réel. Le principal avantage de cette technique est la vitesse à laquelle les échantillons peuvent être traités une fois que l’instrumentation est correctement alignée, car le SRS ne nécessite pas de traitement et de coloration des tissus. Ce protocole est applicable à d’autres applications SRS, pas seulement à l’histologie.
Ces applications comprennent de petites molécules, des médicaments, des cellules et des tissus. Commencez par installer une paire de lentilles achromatiques pour le faisceau de la pompe afin d’agrandir la taille du faisceau laser de deux fois comme point de départ. Placez un objectif de 100 et 200 millimètres à environ 300 millimètres l’un de l’autre.
Alignez ensuite le faisceau de la pompe à travers le centre des deux lentilles. Placez ensuite un miroir après la deuxième lentille pour envoyer le faisceau vers un mur à plus d’un mètre de distance. Tracez le faisceau du miroir au mur avec une carte IR et vérifiez si le faisceau change de taille.
Collotez le faisceau si le faisceau change de taille en fonction de la distance. Combinez les deux faisceaux laser en installant un miroir dichroïque avec plusieurs rétroviseurs de direction pour le réglage. Optimisez le chevauchement spatial de la pompe et de Stokes en surveillant les faisceaux après le miroir dichroïque à deux positions différentes à environ un mètre l’une de l’autre.
Ajustez de manière itérative le rétroviseur de direction suivi du miroir dichroïque pour aligner le faisceau de Stokes avec le faisceau de la pompe. Assurez-vous que les faisceaux combinés sont envoyés au centre des miroirs de balayage du microscope à balayage laser en ajustant une paire de miroirs de direction lorsque les miroirs de balayage sont en position stationnée. Après le condenseur, utilisez une autre paire d’objectifs avec des distances focales de 100 millimètres et 30 millimètres, respectivement, pour relayer le faisceau transmis sur la photodiode, en vous assurant que les deux faisceaux sont contenus dans la photodiode.
Installez ensuite deux filtres passe-bas pour bloquer le faisceau Stokes modulé. Placez un échantillonneur de faisceau dans la trajectoire du faisceau de Stokes pour capter 10% du faisceau et l’envoyer à une photodiode rapide pour détecter le train d’impulsions de 80 mégahertz. Prenez l’une des sorties du tampon de fanout et filtrez-la avec un filtre passe-bande pour obtenir une onde sinusoïdale de 20 mégahertz.
Utilisez ensuite un atténuateur RF pour ajuster le pic de sortie à la tension de crête à environ 500 millivolts. Envoyez la sortie résultante à un déphaseur, ce qui permet un réglage fin de la phase RF avec une source de tension. Envoyez cette sortie à un amplificateur de puissance RF et connectez la sortie de l’amplificateur à la moe électronique.
Après avoir débloqué le faisceau de Stokes, optimisez la profondeur de modulation de la première MOE en plaçant une photodiode dans le trajet du faisceau. Ajustez la tension de la MOE et la plaque quart d’onde jusqu’à ce que la profondeur de modulation apparaisse satisfaisante. Placez une photodiode après le miroir dichroïque pour détecter le faisceau laser.
Bloquez d’abord le faisceau de Stokes, puis zoomez sur l’un des pics d’impulsion de la pompe sur l’oscilloscope. Placez un curseur vertical pour marquer la position temporelle de ce pic avec l’oscilloscope. Maintenant, bloquez le faisceau de la pompe et débloquez le faisceau de Stokes.
Traduisez l’étage de retard pour faire correspondre temporairement les positions de crête sur l’oscilloscope à la position marquée à l’étape précédente. En calculant la distance de retard requise pour faire correspondre les deux faisceaux, puis en allongeant la trajectoire de la poutre la plus rapide ou en raccourcissant la trajectoire de la poutre la plus lente. Ensuite, préparez un échantillon de lame de microscope avec du DMSO et du ruban adhésif double face comme espaceur pour maintenir l’échantillon entre la lame et un couvercle.
Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté du couvercle face à l’objectif du microscope et observez l’échantillon de la pièce I sous éclairage en champ lumineux. Trouvez le foyer de l’échantillon à la fois sur la couche supérieure et inférieure de bulles d’air à l’interface du ruban de verre, puis déplacez le foyer pour qu’il se trouve entre les deux couches du ruban. Ensuite, réglez la sortie du faisceau accordable à 798 nanomètres.
En fonction du débit optique du condenseur, ajustez la puissance optique à environ 40 milliwatts chacun pour la pompe et les faisceaux de Stokes au foyer de l’objectif. Ouvrez ensuite l’image de numérisation dans MATLAB et cliquez sur le bouton intitulé focus pour lancer la numérisation. Réglez le rétroviseur avant le scanner galvo pour centrer le signal CC sur l’écran du canal un.
Déplacez l’étage de retard motorisé et observez de près la sortie de verrouillage affichée sur l’écran du canal deux. Enfin, ajustez le délai pour maximiser l’intensité du signal CA. Réglez le miroir dichroïque pour centrer le signal SRS sur le canal CA.
Ajustez ensuite la phase de l’amplificateur de verrouillage pour maximiser le signal. Après avoir monté l’échantillon, glissez sur le microscope et ajustez la puissance des deux faisceaux à environ 40 milliwatts chacun au foyer de l’échantillon, comme démontré précédemment. Ouvrez l’image de numérisation à partir de MATLAB.
Ensuite, trouvez le signal SRS maximal en balayant à travers l’étage de retard correspondant au pic Raman de 2 913 centimètres inverses de DMSO. Acquérir une image SRS correspondant au pic Raman de 2 913 centimètres inverses du DMSO. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez une petite zone au centre du cadre.
Utilisez la fonction de mesure pour calculer la moyenne et l’écart-type des valeurs dans la zone sélectionnée. Pour l’étalonnage de l’accès à la fréquence, enregistrez un balayage hyperspectral avec la plage d’étages de retard couvrant les pics Raman de 2, 913 et 2 994 centimètres inverses de DMSO. Enregistrez ensuite les positions de scène correspondant à l’ensemble de données hyperspectrales.
Effectuez une régression linéaire pour les positions des étages et les décalages Raman à 2, 913 et 2 994 centimètres inverses. À l’aide de l’équation de régression linéaire, convertissez les positions de retard en fréquences Raman correspondantes. Pour l’étalonnage de la résolution spectrale, estimez la position de l’étage en fonction de la position précédente avec l’augmentation de la longueur du chemin optique due à l’insertion de tiges.
Réaligner le chevauchement spatial des poutres en raison de la légère déviation de la poutre lorsque des tiges de verre sont ajoutées. Installez un séparateur de faisceau polarisant, une plaque quart d’onde et une deuxième MOE dans le chemin de faisceau de trempage après la première MOE. Débranchez l’entrée de signal de la deuxième moE, puis branchez l’entrée de signal à la première moE et allumez-la.
Modulez le faisceau de Stokes à 20 mégahertz en envoyant le faisceau à travers la première MOE. Ajustez l’inclinaison et la position de la première MOE pour vous assurer que le faisceau est centré à travers le cristal de l’EOM. Préparez un échantillon de lame de tissu avec du ruban adhésif double face, une lame de microscope et du verre de couverture.
Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté du couvercle face à l’objectif du microscope. Pour l’imagerie SRS en mode épi, installez une plaque demi-onde avant que le faisceau n’entre dans le microscope pour modifier la polarisation du faisceau entrant dans le microscope. Placez un séparateur de faisceau polarisant au-dessus de l’objectif pour permettre au faisceau rétroréfléchi dépolarisé d’atteindre le détecteur.
Ensuite, utilisez une lentille achromée de 75 millimètres et une lentille asphérique de 30 millimètres pour relayer les photons rétrodiffusés de l’ouverture arrière de l’objectif au photodétecteur. Montez le détecteur pour recueillir la lumière rétrodiffusée dirigée par le séparateur de faisceau polarisant. Installez ensuite un filtre pour empêcher le faisceau modulé d’entrer dans le détecteur.
La variation de la longueur des tiges affecte la résolution spectrale. Lorsqu’aucune tige de gazouillis en verre n’est utilisée, les deux pics Raman du DMSO ne sont pas résolus du tout. Une augmentation du nombre de tiges de gazouillis de verre commence à résoudre les deux pics à un point satisfaisant.
Le gazouillis apparié résout les deux pics et peut être utilisé pour calibrer les positions des étages en fonction de la fréquence. Deux trains d’impulsions retardés de polarisation orthogonale utilisés pour imager les spectres DMSO montrent le délai entre les excitations SRS avec une profondeur de modulation acceptable et une séparation temporelle. En revanche, un mauvais déphasage SRS bicolore donne lieu à des pics inversés ou négatifs.
L’imagerie SRS bicolore en temps réel à 2 850 et 2 930 centimètres inverses de tissu cérébral de souris ex vivo est montrée ici. Les images brutes de lipides et de protéines ont été codées par couleur pour produire une seule image représentant les contributions lipidiques et protéiques. La fausse coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a également été réalisée pour imiter la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour des applications pathologiques.
Le chevauchement spatial-temporel et l’optimisation de la résolution spatiale sont les étapes les plus importantes pour l’approche de focalisation spatiale de SRS. Cette méthode est généralement applicable à d’autres expériences de microscopie à sonde à pompe telles que la microscopie à absorption transitoire. La méthode permet également l’imagerie de molécules non fluorescentes dans les cellules et les tissus.
La méthode présentée ici accélère le temps d’acquisition de l’image pour la traduction future de l’histologie Raman stimulée en clinique.
