Nous tenons à remercier Michael J. Bruno, Radda Rusinova et Jon T. Sack pour de nombreuses discussions stimulantes. Le soutien financier du NIH, et de l&#39;ARRA R01GM021342 complément R01GM021342-35S1, et la Josiah Macy Jr. Foundation pour l&#39;OSA, le Tri-I Programme des OHC pour HII et L. Les Iris et Leverett S. Woodworth Scientifique médical bourses et subventions du NIH MSTP GM07739 pour RK.

1. Générer ANTS-remplie liposomes <ol><li> Au jour 1, éliminer le solvant organique à partir des lipides. </li><li> Retirer du congélateur lipides et laisser s&#39;équilibrer à température ambiante. </li><li> Ajouter 0,6 mL de 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) des lipides dans une solution de chloroforme dans une fiole de 25 ml à fond rond. </li><li> Continuellement faire tourner la fiole pendant le séchage sous azote, jusqu&#39;à ce que tous le chloroforme a évaporé et une fine pellicule blanche de couches de lipides toute la moitié inférieure de la fiole. </li><li> Sec dans un dessiccateur sous vide pendant une nuit. </li></ol><ol><li> Le jour 2, préparation de l&#39;échantillon avec le fluorophore qui sera incorporé dans les vésicules. </li><li> Réhydrater dans 100 mM de NaNO 3, 25 mM ANTS (sel de Na), 10 mM d&#39;HEPES. Utilisez HNO 3 ou NaOH pour ajuster le pH à 7,0. Chaque molécule ANTS a 2 + Na, pour un total de 150 mM [Na +]. Ajouter 1,671 ml d&#39;électrolyte pour obtenir une suspension à 10 mM de lipides. </li><li> Suspension de Parafilm et vortex à fond. </li><li> Protéger de la lumière de l&#39;échantillon de papier aluminium et laissez-âge nuit à température ambiante. </li></ol><ol><li> Le Jour 3, faire de grandes vésicules unilamellaires et de supprimer tous les fluorophores de l&#39;extérieur des vésicules. </li><li> Soniquer pendant 1 min dans un sonicateur de faible puissance. </li><li> Gel-dégel de l&#39;échantillon 5-6 fois, avec à chaque fois 5 minutes sur la glace sèche et à 5 minutes de chaud (~ 50 ° C) de l&#39;eau. </li><li> Extruder la suspension lipidique avec une mini-extrudeuse Avanti. Mettre en place le mini-extrudeuse avec un 0,1 um polycarbonate filtre et supports (voir le manuel extrudeuse pour les détails). Extruder la suspension avant et en arrière 21 fois de telle sorte que la suspension se termine sur la seringue opposée. Lorsque plusieurs lots sont extrudés, n&#39;oubliez pas de charger des échantillons avec la même seringue. Lors de l&#39;extrusion de la suspension lipidique trouble initial devrait devenir presque translucide (il sera toujours jaune due à la fluorophore ANTS). Si l&#39;extrusion devient soudainement plus facile et moins de pression est nécessaire pour déplacer à travers le filtre, le filtre peut avoir rompu et devront être remplacés. </li><li> Retirer ANTS externes en exécutant la suspension extrudé sur une colonne de dessalage PD-10 en utilisant un protocole de gravité. Equilibrer la colonne avec 20-30 ml de Na-tampon (140 mM de NaNO 3, 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,0, n&#39;oubliez pas d&#39;utiliser HNO 3 ou NaOH pour ajuster le pH). Ajouter 1,5 mL de la suspension lipidique extrudé à la colonne et laisser s&#39;infiltrer po porter le volume total de l&#39;échantillon à 2,5 ml par ajout de 1 mL de Na-tampon. Après le tampon est pleinement intégré dans la colonne et rien n&#39;est fuites, éluer les liposomes avec 3 mL de Na-tampon et de recueillir l&#39;échantillon résultant. L&#39;ANTS résultant remplis LUV solution mère devrait contenir environ lipides 4-5 mm et apparaissent translucides blanc laiteux. Protéger l&#39;échantillon de la lumière avec du papier. </li><li> Si la solution stock n&#39;est pas utilisée immédiatement, stocker à 13 ° C pour un maximum de 7 jours. Attention: ne pas congeler ou refroidir la solution lipidique en dessous de son liquide à la température de transition cristal-phase (~ 12 ° C), car cela détruirait l&#39;intégrité des vésicules »et le fluorophore va s&#39;échapper. </li></ol> 2. Mélanger une solution de fluorescence <ol><li> 24 heures avant d&#39;utiliser, diluer les liposomes et incuber avec gramicidine (à 13 ° C). Équilibrage de gramicidine entre les monocouches les vésicules lipidiques &#39;intérieur et extérieur est un processus lent, exigeant une longue période d&#39;incubation. </li><li> Bien tourbillons de l&#39;ANTS rempli de solution stock LUV LUV comme avoir une densité&gt; 1 g / ml et sera donc de sédiments dans les solutions. </li><li> Mélanger l&#39;ANTS rempli LUV 01h20 stock dans Na-tampon. Mélanger tous les liposomes pour une utilisation en une seule journée d&#39;expériences ensemble dans un flacon unique pour améliorer l&#39;uniformité de l&#39;échantillon. </li><li> Séparez 3 / 4 des liposomes et ajouter 260 nM pré-dilué dans le DMSO gramicidine (500 pg / mL). </li><li> Pour le 1 / 4, ajouter le même volume de DMSO (sans gramicidine) pour maintenir la concentration en solvant constante dans tous les échantillons. </li></ol> 3. Mise en place de l&#39;instrument de fluorescence <ol><li> Nous utilisons une Applied Photophysics SX.20 stopped-flow spectrofluorimètre avec contrôle de température pour mesurer le taux d&#39;extinction de la fluorescence. </li><li> Tournez les instruments sur une heure à l&#39;avance pour permettre l&#39;échauffement. Les composants sont: ordinateur, unité de contrôle électronique, au bain-marie (à la fois froide et chauffage), l&#39;alimentation de la lampe et réservoir d&#39;azote. </li><li> Mettre en place les conditions d&#39;enregistrement en utilisant le logiciel Pro-Data SX. </li><li> Régler la longueur d&#39;onde d&#39;excitation à 352 nm monochromateur et ouvertures largeur de fente pour une excitation à 1 / 1. </li><li> Utilisez un λ = 455 nm filtre passe-haut pour enregistrer l&#39;émission. </li><li> Utilisez le &quot;maintien en pression&quot; réglage, qui permet à l&#39;instrument pour maintenir la pression d&#39;azote lors de l&#39;enregistrement et empêche ainsi les oscillations de pression (et les artefacts d&#39;enregistrement) pendant les premières millisecondes. </li><li> Réglez &quot;Time &quot;à 1 s et« Points »pour 5000. </li><li> Utilisez la boîte de répéter et d&#39;ajuster le nombre de répétitions, nous utilisons normalement 9 et 13 répétitions pour le tampon et fonctionne quencher, respectivement. </li><li> Bain-marie de température doit être réglée à 25 ° C, la température doit être contrôlée dans le logiciel SX. </li><li> Réglez le volume du disque à 120 uL, ce qui signifie que chaque fois que l&#39;instrument fonctionne un échantillon, il se mélange 60 pi de chacun des deux seringues. Avec cette configuration instrumentale, un volume 120 pi donne un temps mort de ≈ 1,2 ms. </li><li> Régler la haute tension (gain) sur le détecteur de fluorescence pour la sortie de l&#39;ANTS-liposome pour être autour de 8. Pour un mélange norme expérimentale du gain devrait être de 400 à 420 V. Certains médicaments sont fluorescentes, de telle sorte qu&#39;ils peuvent saturer le signal de fluorescence. Dans ces cas, le gain / tension doit être diminué. </li><li> Toujours charger l&#39;échantillon fluorescent dans la seringue de gauche et de tampon / désactiveur dans la seringue droite. Assurez-vous de bien vortex tous les échantillons contenant des liposomes avant le chargement, et être conscient que la LUV avec le temps va s&#39;installer dans la seringue. </li></ol> 4. Faire une expérience <ol><li> Préparer un échantillon de fourmis chargées LUV soit avec un solvant ou composé, et charger dans le spectrofluorimètre avec soit Na-tampon ou Tl-désactiveur (50 mM TlNO 3, 94 mM de NaNO 3, 10 mM d&#39;HEPES à pH 7,0). </li><li> Utiliser 1,5 mL dilué ANTS-LUV solution, avec ou sans gramicidine, préparé la veille. </li><li> Ajouter le composé à la concentration désirée ou le solvant pour les contrôles. Gardez la concentration en solvant à un minimum et constante à travers tous les échantillons. Les concentrations devront être ajustées avec toute nouvelle (nom inconnu) composé à atteindre les résultats souhaités dose-réponse gamme. Incuber pendant 10 min à 25 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Vortex, le LUV échantillon et la charge dans la seringue à gauche. Chargez le Na-tampon ou Tl-désactiveur dans la seringue droite. </li><li> Bien éliminer les bulles d&#39;air des deux échantillons en poussant les seringues avant en arrière. </li><li> Assurez-vous que les seringues sont chargés aussi avant de fermer les vannes. Charge inégale se traduira par de pré-mélange de solutions avant qu&#39;ils n&#39;atteignent la chambre d&#39;enregistrement. </li><li> Pour l&#39;échantillon de toute première fois, enregistrer la fluorescence avec Na-tampon, répéter 4 fois, régler la haute tension (gain) que nécessaire, et répétez 5 fois. </li><li> Pour les échantillons restants, fiche 9 répète avec Na-tampon. </li><li> Remplacer le Na-tampon avec l&#39;extincteur et Tl-record de 13 répétitions. </li><li> Rincer à l&#39;eau et continuer avec l&#39;échantillon suivant. Comme les contrôles que nous utilisons des échantillons avec: pas de gramicidine et de solvant, pas de gramicidine et avec la concentration en composés au maximum, à la fois avec la gramicidine et de solvant. </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> Transfert des résultats à l&#39;ordinateur d&#39;analyse. Lire toutes les données dans MATLAB pour l&#39;analyse. Pour chaque échantillon, lue dans toutes les tampons et répète quencher, excluant les quatre premiers dans chaque cas, comme ceux contenant des artefacts de mélange. En supposant un volume d&#39;entraînement de 120 uL cela prend un peu moins de quatre coups de complètement vider le mélange précédent de la tubulure stopped-flow. </li><li> Les répétitions de tampon pour tous les échantillons devraient être très similaires. S&#39;il ya un changement important dans le signal de fluorescence, qui dépend de la concentration en composés, puis le composé lui-même peut être fluorescent et il peut être nécessaire d&#39;abord de soustraire ce signal supplémentaire fluorescence avant la normalisation des échantillons. </li><li> Manuellement passer par les traces et de supprimer le «mauvais» répète: répète contenant des pointes ou des écarts par rapport aux multi-exponentiel en raison d&#39;artefacts de mélange et / ou des bulles. </li><li> Normaliser les répétitions désactiveur à la valeur moyenne de départ de la mémoire tampon se répète pour chaque échantillon. Combinez les moyennes de tous les échantillons dans un graphique pour la visualisation. </li><li> Traces enregistrées sans gramicidine devraient tous être semblables et montrent presque aucune extinction de la fluorescence; il peut y avoir une réduction lente du signal de fluorescence due à la lenteur des fuites de Tl + à travers la bicouche des vésicules 8. Si l&#39;échantillon sans gramicidine et aucun modificateur montre trempe importantes, puis les vésicules se sont détériorées et ne doivent pas être utilisés plus loin. Si les échantillons ne présentant aucune gramicidine, mais avec le modificateur montrent trempe significatif, alors le modificateur perturbe la bicouche des vésicules à un point tel qu&#39;il permet le fluorophore ou désactiveur de traverser la bicouche. </li><li> Si le composé altère les propriétés bicouche lipidique, telle que détectée par les canaux de gramicidine, le cours du temps de fluorescence sera visiblement altérée. </li><li> Pour chaque échantillon, une exponentielle étirée <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> par exemple 4) est apte à la première de 200 à 100 ms de la courbe de la trempe de fluorescence normalisée de l&#39;individu répète et le taux <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Figure 2" /> 4calculé à 2 ms. Moyennes et écarts-types sont calculés pour un échantillon donné de tous les répétitions individuelles. </li><li> Enfin, déterminer la variation relative des taux d&#39;étancher en normalisant à l&#39;échantillon de contrôle le plus proche dans le temps qui a gramicidine et aucun modificateur. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: L&#39;essentiel de la fluorescence étancher basé test pour détecter les changements dans les propriétés de bicouche lipidique haut à gauche:. Un zoom sur une vésicule lipidique unique avec l&#39;ANTS, plus NaNO 3 à l&#39;intérieur et NaNO 3 plus TlNO 3 à l&#39;extérieur. En haut à droite: Le signal de fluorescence enregistrées à l&#39;aide (sous forme de haut en bas) ANTS-remplie vésicules sans quencher, avec quencher, avec extincteur et pré-dopé avec 87, 260 et 780 nm gramicidine. En bas: Représentation schématique de la chambre de mélange stopped-flow. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Une photo d&#39;écran du logiciel Pro-Data SX illustrant les différents panneaux référencé dans la description du dispositif expérimental. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3:. Déterminations répétées multiples du signal de fluorescence des fourmis-chargé LUV avec Na-buffer Les quatre premières répétitions sont toujours exclus, car ils contiennent des artefacts de mélange. La tubulure reliant les seringues échantillon à la cellule de mélange ont un volume défini, donc le répète quelques premières va nous donner une lecture de ce qui était auparavant dans le tube: l&#39;eau pour la répétition de 1 et 2, une combinaison d&#39;eau et de l&#39;échantillon pour répéter 3, la plupart de l&#39;échantillon pour répéter 4, et seulement de l&#39;échantillon pour les répétitions restantes. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4:. Déterminations répétées multiples du signal de fluorescence des fourmis-chargé LUV avec Na-tampon et TL-désactiveur Les quatre premières répétitions ont été retirés de ces deux conditions. De plus, pour les mesures Tl-quencher, répétez 8 doit être retiré en raison d&#39;artefacts, des bulles d&#39;air le plus probable. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Figure 5" /> . Figure 5: Effet de la capsaïcine (PAC) sur le cours du temps de la trempe de fluorescence ANTS (A) normalisé signal de fluorescence plus de 1 s, des points gris dénotent les résultats de toutes les répétitions (n&gt; 5 par condition); lignes rouges indiquent la moyenne de tous répète. (B) La première tranche de 100 ms, des points gris dénotent les résultats d&#39;une répétition unique pour chaque condition; lignes rouges sont étirés s&#39;adapte exponentielle (2 - 100 ms) à ceux répète. La ligne pointillée bleue représente la marque de 2 ms, l&#39;heure à laquelle le taux d&#39;extinction est déterminé. Dans les deux A et B et la trace du haut montre des résultats en l&#39;absence de Tl +; les deux prochaines traces montrent des résultats en l&#39;absence de GA, avec Tl + Cap ±; les quatre traces inférieures montrent des résultats avec 260 nM de gA et Tl +, où les chiffres dénotent [Cap] en uM. Le taux de la trempe de Cap uM 0, 10, 30 et 90, tel que déterminé par le taux d&#39;une exponentielle étirée, sont de 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 et 247 ± 27 (moyenne ± SD, n&gt; 8) , respectivement.

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Une demande de brevet provisoire qui couvre les méthodes décrites dans le manuscrit a été déposé. Les co-inventeurs sont HII et OSA.

Nous avons démontré un rapide test basées sur la fluorescence pour déterminer le potentiel de modifier bicouche de médicaments et d&#39;autres petites amphiphiles. Les composés qui modifient les propriétés bicouche sont susceptibles d&#39;altérer la fonction des protéines membranaires dans une indirecte, de manière non spécifique, qui peut contribuer à &quot;hors cible&quot; effets des médicaments. Le test exploite la puissance des canaux gramicidine tant que sondes pour des changements de propriétés bic...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Beaucoup de médicaments et d&#39;autres petites molécules utilisées pour moduler la fonction biologique sont des amphiphiles qui s&#39;adsorbent à l&#39;interface bicouche / solution et ainsi modifier les propriétés bicouche lipidique. Ceci est important car les protéines membranaires sont énergétiquement couplées à leur hôte en bicouche interactions hydrophobes. Les changements dans les propriétés bicouche ainsi modifier la fonction des protéines membranaires, qui offre un moyen indirect pour amphiphiles pour moduler la fonction des protéines et un mécanisme possible pour &quot;hors cible&quot; effets des médicaments. Nous avons déjà développé un essai électrophysiologique pour détecter des changements dans les propriétés de bicouche lipidique utilisant des canaux de gramicidine linéaires comme sondes 3,12. Canaux gramicidine sont des mini-protéines formées par la dimérisation de deux transbilayer non-conductrice sous-unités. Ils sont sensibles aux changements dans leur environnement membranaire, ce qui les rend puissants sondes pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant. Nous avons maintenant la preuve un dosage par fluorescence pour détecter des changements dans les propriétés bicouche en utilisant les mêmes canaux que les sondes. Le dosage est basé sur la mesure de l&#39;évolution temporelle de la trempe de fluorescence de fluorophores chargés vésicules unilamellaires grande partie grâce à l&#39;entrée d&#39;un désactiveur à travers les canaux de gramicidine. Nous utilisons la fluorescence indicateur / désactiveur paire 8-aminonaphtalène-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl + qui a été utilisé avec succès dans d&#39;autres dosages extinction de la fluorescence 5,13. Tl + imprègne la bicouche lipidique lentement 8 mais traverse aisément la réalisation des canaux de gramicidine 1,14. La méthode est évolutive et adaptée pour les deux études mécanistes et criblage à haut débit de petites molécules pour la bicouche de perturbations, et le potentiel &quot;hors cible&quot;, les effets. Nous constatons que les résultats en utilisant cette méthode sont en bon accord avec les précédents résultats électrophysiologiques 12.

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Nous introduisons une vitesse basées sur la fluorescence de dosage qui surveille le taux de la trempe de fluorescence comme une mesure de l&#39;activité du canal gramicidine. Les canaux de gramicidine sont utilisés comme capteurs de force moléculaire pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant.

Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K vues.  Weill Cornell Medical College. Nous introduisons une vitesse basées sur la fluorescence de dosage qui surveille le taux de la trempe de fluorescence comme une mesure de l'activité du canal gramicidine. Les canaux de gramicidine sont utilisés comme capteurs de force moléculaire pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant.

Vidéo: Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Application d&#39;une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Recherche

Biologie

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Méthodes Single Molecule pour surveiller les changements dans les propriétés élastique bicouche

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membranes lipidiques bicouches attachées pour surveiller le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Nettoyage optique des tissus végétaux pour l’imagerie par fluorescence

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...