Les auteurs tiennent à remercier Emilie Josse pour la critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la fondation « La Ligue contre le Cancer », la Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer et le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Préparation de grandes vésicules unilamellaires (LV)
<ol><li>Préparez les LV pour leur utilisation comme imitations de membrane cellulaire pour le test de fuite de fluorescence.</li>
	<li>Mélanger avec une seringue en verre Hamilton phosphatidylcholine (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyéline (SM, 760,22 g/mol) et cholestérol (Chol, 386,65 g/mol) au rapport molaire 4:4:2. La solution lipidique est obtenue à partir d’une solution type de chaque lipide solubilisé dans un solvant méthanol/chloroforme (3/1; volume/volume) à 25 mg/mL dans une fiole à fond rond en verre de 25 mL. Sur la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM et 2 μmol de Chol, la solution lipidique est obtenue à partir d’une solution stock en mélangeant respectivement 126 μL, 117 μL et 31 μL. ATTENTION : Le méthanol est un solvant toxique et inflammable et le chloroforme est toxique et cancérigène. Les deux doivent être manipulés avec la protection appropriée sous une hotte.</li>
	<li>Évaporer le méthanol/chloroforme à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide pendant 45 à 60 min à 60 °C jusqu’à la formation d’un film lipidique séché.</li>
	<li>Préparez deux solutions tampons HEPES en stock. Préparer le tampon HEPES 1 en mélangeant 20 mM hePES (238,3 g/mol) et 75 mM de NaCl (58,44 g/mol) et ajuster le pH à 7,4. Préparer le tampon HEPES 2 en mélangeant 20 mM HEPES et 145 mM naCl et ajuster le pH à 7,4. Les tampons HEPES peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 mois. REMARQUE: Il est recommandé de vérifier l’osmolarité des tampons à l’aide d’un osmomètre.</li>
	<li>Préparer la solution d’hydratation lipidique en dissolvant le couple colorant-quencher fluorescent imperméable à membrane, l’acide 8-aminonaphtalène-1, 3, 6-trisulfonique, le sel disodique à 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) et le bromure de p-xylène-bispyridinium à 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) dans une solution tampon HEPES. Le mélange d’ANTS avec DPX conduit à une solution de couleur jaune. Pour atteindre les concentrations de 12,5 mM d’ANTS et de 45 mM de DPX, dissoudre respectivement 21,4 mg et 76 mg dans 4 mL de tampon HEPES 1. REMARQUE: La solution d’hydratation lipidique peut être conservée pendant 2 semaines à 4 ° C en enveloppant le tube avec du papier d’aluminium.</li>
	<li>Reconstituer les vésicules multilamellaires (MLV) en resusmettant le film lipidique séché avec 1 mL de la solution d’hydratation lipidique et en vortexant jusqu’à dissolution du film lipidique séché. Assurez-vous que la solution est complètement solubilisée car de petits agrégats lipidiques auront un impact négatif sur les étapes précédentes. Vérifiez également la paroi de la fiole à fond rond en verre pour vous assurer qu’il ne reste pas de film lipidique. REMARQUE: La solution apparaîtra opalescente et jaune clair après la solubilisation.</li>
	<li>Soumettre les vésicules à cinq cycles de congélation/dégel pour obtenir des vésicules unilamellaires. Effectuez chaque cycle en mettant la fiole à fond rond en verre pendant 30 s dans de l’azote liquide pour l’étape de congélation, puis en la laissant au bain-marie pendant 2 min pour l’étape de décongélation. REMARQUE: La température de l’eau du bain doit être supérieure de 5 à 10 ° C à la température de fusion des lipides.</li>
	<li>Préparez l’extrudeuse lipidique en insérant deux supports filtrants préliminaires humidifiés avec un tampon HEPES dans chaque pièce d’extrudeuse en polytétrafluoroéthylène (PTFE) placée dans la cartouche de l’extrudeuse métallique.</li>
	<li>Placez une membrane en polycarbonate humidifié HEPES (taille des pores de 0,1 μm, diamètre de 25 mm) sur le dessus d’un support de filtre.</li>
	<li>Assemblez les deux bidons d’extrudeuse métallique et vissez-les.</li>
	<li>Placez l’extrudeuse assemblée dans le support et introduisez une seringue de 1 mL dans le trou approprié à l’extrémité de chaque pièce d’extrudeuse en polytétrafluoroéthylène. L’extrusion correspond au passage du liquide testé d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate.</li>
	<li>Testez l’extrudeuse avec 1 mL de tampon HEPES chargé dans l’une des seringues de 1 mL pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites ou de problèmes.</li>
	<li>Remplacez le tampon HEPES de 1 mL par l’échantillon MLV.</li>
	<li>Effectuer l’extrusion en faisant passer l’échantillon de MLV d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate au moins 21 fois pour obtenir des LV uniformes de même taille. REMARQUE: L’extrusion doit être effectuée à une température supérieure à la température de fusion du mélange lipidique.</li>
</ol>2. Purification des LV
<ol><li>Préparez une purification de colonne pour éliminer l’excès d’ANTS et de DPX non encapsulés.</li>
	<li>Introduire le gel de dextran réticulé (G-50) mis enssais en milieu aqueux avec 0,01 % de NaN3 (65 g/mol) dans une colonne de chromatographie liquide (Luer Lock, non gainé, 1,0 cm x 20 cm, volume du lit 16 mL) jusqu’à 1 cm sous le haut de la partie incolore de la colonne.</li>
	<li>Ouvrez le robinet et laissez le liquide s’écouler pour déposer le gel de dextran réticulé.</li>
	<li>Lavez la colonne en éluant avec 20 mL de tampon HEPES 2 et éliminez le débit de sortie de la colonne.</li>
	<li>Fermez le robinet une fois que le volume mort de solvant au-dessus de la colonne est minimisé (<100 μL) mais suffisant pour éviter tout séchage du gel de dextran réticulé.</li>
	<li>Placez les LLU fraîchement extrudés (jaunes) sur la colonne et laissez-les entrer dans le gel de dextran réticulé.</li>
	<li>Ajoutez continuellement le tampon HEPES 2 à la colonne pour effectuer la purification LUV.</li>
	<li>Éluez environ 2 mL de tampon HEPES 2 (n’oubliez pas de remplir régulièrement le haut de la colonne pour éviter de sécher le gel de dextran réticulé) : la solution jaune libre d’ANTS et de DPX migre plus lentement que les liposomes.</li>
	<li>Commencez à collecter les LV purifiés dans des tubes (1,5 mL).</li>
	<li>Observez les gouttes d’éluant de la colonne et lorsqu’elles deviennent opalescentes, elles contiennent des liposomes. Changez le tube pour récupérer la fraction contenant du LUV.</li>
	<li>Éluez jusqu’à ce que les gouttes ne soient plus opalescentes (~1 mL). Ensuite, éluez encore 0,5 mL dans une fraction séparée, puis arrêtez d’éluer. REMARQUE: Les étalons sont maintenant disponibles dans une large gamme de poids moléculaires, sous forme de kits ou de poids moléculaires individuels pour calibrer le volume d’élution des LV.</li>
	<li>Enveloppez les tubes avec les LUN dans du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment du colorant de fluorescence.</li>
	<li>Lavez la colonne avec un tampon HEPES de 20 mL 2.</li>
	<li>Les LV peuvent ensuite être conservés pendant une semaine à 4 °C. REMARQUE: Comme la stabilité du LUV peut dépendre de la concentration et de la composition du LUV, ainsi que de la force ionique, la taille des LUV doit être contrôlée à l’aide d’un instrument de diffusion dynamique de la lumière (DLS) (voir rubrique 4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV) avant chaque essai.</li>
</ol>3. Quantifier la concentration de LV
<ol><li>Estimer la concentration de LUV à l’au moyen d’un kit de quantification des phospholipides, ce qui permet d’évaluer la concentration de choline19. Ce test peut être appliqué lorsque les phospholipides contenant de la choline contiennent de la tête polaire sont substantiels (>50% des LV).</li>
	<li>Préparer le réactif colorant en dissolvant 18 mg de substrat chromogène dans 3 mL de tampon fourni.</li>
	<li>Chargez une cuvette en polystyrène, 10 x 10 x 45 mm, avec 3 mL de réactif de couleur.</li>
	<li>Utilisez le réactif de couleur pure comme condition vide (blank). Ajouter 20 μL d’échantillon de LUV (essai) ou 20 μL de solution étalon de concentration connue de choline (étalon).</li>
	<li>Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 37 °C dans toutes les conditions (Blank, Test et Standard).</li>
	<li>Mesurer l’absorbance (densité optique, OD) de l’échantillon d’essai et de la solution étalon avec la solution vierge comme témoin à 600 nm avec un spectrophotomètre.</li>
	<li>Vérifiez les valeurs OD qui permettent d’estimer la concentration lipidique des LV, C[LUV], en équivalent choline par rapport à la norme de concentration connue.</li>
	<li>Effectuez le calcul à l’aide de l’équation suivante : C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l) REMARQUE: Le kit de quantification des phospholipides a fourni une solution étalon de chlorure de choline (139,6 mg / l) à 54 mg / dL correspondant à la concentration molaire de C [Standard] = 3,87 mmol / L. OD Sample et OD Standard sont les absorbances mesurées à 600 nm pour les solutions LUV et Choline, respectivement.</li>
</ol>4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV
<ol><li>Effectuez une mesure à l’aide d’un instrument DLS afin de déterminer la taille du LUV (en nm) et l’indice de polydispersité (PdI).</li>
	<li>Programmer la « procédure de fonctionnement standard » (SOP) appropriée en indiquant la viscosité du solvant/tampon et de la cuvette utilisée.</li>
	<li>Placer 500 μL de la solution de LUV dans une cuvette semi-micro en polystyrène.</li>
	<li>Insérez la cuvette semi-micro en polystyrène dans un instrument DLS.</li>
	<li>À température ambiante, mesurer la distribution granulométrique en termes de taille moyenne (moyenne Z) de la distribution des particules et d’homogénéité (indice de polydispersité, PdI).</li>
	<li>Tous les résultats sont obtenus à partir de deux mesures indépendantes effectuées chacune en trois cycles répétitifs. REMARQUE: Les valeurs standard pour les LGV seront d’une taille moyenne de 137 ± 7 nm avec un PdI de 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>5. Préparation de solutions peptidiques
<ol><li>Préparez une solution stock du peptide, qui doit être analysée pour le test de fuite.</li>
	<li>Dissoudre la poudre peptidique (pureté >95 %) dans de l’eau pure (p. ex., 1 mg de peptide dans de l’eau pure de 500 μL). REMARQUE: Il est recommandé de diluer les peptides dans de l’eau pure et d’éviter la solubilisation au diméthylsulfoxyde (DMSO), qui pourrait induire des artefacts (par exemple, la perméabilisation membranaire20).</li>
	<li>Vortex la solution peptidique pendant 5 s.</li>
	<li>Sonicate la solution peptidique dans un bain de sonication à l’eau pendant 5 min puis centrifuger pendant 5 min à 12 225 x g. Recueillir le surnageant pour la détermination de la concentration.</li>
	<li>Mesurez l’absorbance à 280 nm de trois dilutions peptidiques indépendantes, puis calculez la concentration peptidique en utilisant son coefficient d’extinction molaire ε (en fonction de la teneur en tryptophane et en tyrosine dans la séquence peptidique) et la règle de Beer-Lambert. REMARQUE: Si le peptide contient du tryptophane et de la tyrosine, le coefficient d’extinction molaire ε est calculé sur la base de tryptophane ε = 5 690 M-1cm-1 et Tyrosine ε = 1 280 M-1cm-1. Si la séquence peptidique ne contient pas de tryptophane ou de tyrosine, un autre test colorimétrique pourrait être effectué pour mesurer la concentration (par exemple, BCA ou Bradford).</li>
	<li>Diluer la solution peptidique dans de l’eau pure jusqu’à une solution finale de 100 μM et conserver à 4 °C. REMARQUE: Dans l’eau pure, aucune dégradation peptidique ne se produit pendant le stockage à 4 °C. Cependant, la concentration en peptides doit être mesurée toutes les 2 semaines pour s’assurer qu’aucune évaporation de l’eau ne se produit.</li>
</ol>6. Essai de fuite de fluorescence
<ol><li>Le test de fuite de fluorescence est mesuré sur un spectrofluoromètre à température ambiante. La longueur d’onde d’excitation et d’émission est fixée à Ex = 360 nm ± 3 nm et Em = 530 nm ± 5 nm, respectivement.</li>
	<li>Diluer les LV dans un tampon HEPES 2 de 1 mL jusqu’à une concentration finale de 100 μM dans une cuvette à fluorescence de quartz. Ajouter un agitateur magnétique pour homogénéiser la solution pendant l’expérience.</li>
	<li>Mesurez les LV seuls pendant les 100 premières s, entre t = 0 s et t = 99 s afin d’accéder à la fluorescence de fond. REMARQUE: Les LV seuls ont également pu être mesurés pendant toute l’expérience (15 min) afin d’accéder à la fluorescence de fond et aux fuites potentielles.</li>
	<li>Par la suite, mesurez la fuite comme une augmentation de l’intensité de fluorescence lors de l’ajout d’aliquotes de solution peptidique pendant les 900 prochaines s (15 min). Ce protocole est réalisé pour chaque concentration de peptide testée de 0,1 μM à 2,5 μM.</li>
	<li>Enfin, une fluorescence de 100 % a été obtenue en solubilisant les LV par addition de 1 μL de Triton X-100 (0,1 %, v/v), ce qui a donné la sonde complètement non inextinguée entre t = 1 000 s et t = 1 100 s.</li>
</ol>7. Quantification de la fuite
<ol><li>Supprimer les valeurs obtenues après t = 1 090 s afin de conserver le même nombre de points pour chaque condition testée.</li>
	<li>Calculer la fluorescence minimale, Fmin, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 0 s et t = 49 s (LGV seuls).</li>
	<li>Calculer la fluorescence maximale, Fmax, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 1 041 s et t = 1 090 s (LV avec Triton X-100).</li>
	<li>Calculez le pourcentage de fuite (%Fuite) à chaque point temporel (t = x), selon l’équation suivante : %Fuite(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Calculer la moyenne et l’écart-type pour les valeurs obtenues avec différentes préparations LUV (n ≥ 2) pour la même condition.</li>
	<li>Tracez le pourcentage de fuite, %Fuite(t=x),en fonction du ou des temps(s).</li>
</ol>

<ol>
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Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li><li>Thor&#233;n, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nord&#233;n, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation.">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions.">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li><li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li><li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Le test de fuite de fluorescence présenté est une méthode simple et rapide pour traiter la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules. Facile à faire, il permet également une comparaison indirecte entre différents peptides interagissant avec la membrane ou d’autres molécules interagissant avec la membrane. En ce qui concerne les étapes critiques du protocole, comme ce test fournit des valeurs relatives entre la valeur de référence (LV seules) et la libération maximale de flu...

Après leur découverte dans les années quatre-vingt-dix, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été développés pour favoriser une livraison cellulaire efficace des cargaisons à travers la membraneplasmique 1,2. Les CPP sont généralement des peptides courts, généralement de 8 à 30 acides aminés, ayant une grande variété d’origines. Ils ont d’abord été définis comme des porteurs « à translocation directe », ce qui signifie qu’ils étaient capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules indépendamment de toute voie endocytotique, ni besoin en énergie ni implication des récepteurs. Cependant, d’autres investigations ont révélé que ces premières observations provenaient principalement d’une surestimation de la fluorescence due à l’artefact expérimental et/ou à des protocoles de fixation utilisant du méthanol3. De nos jours, il est largement admis que l’absorption du RPC se fait à la fois par endocytose et par translocation indépendante de l’énergie4,5,6,7 en fonction de différents paramètres tels que la nature de la cargaison, le lien utilisé entre le CPP et la cargaison, la lignée cellulaire étudiée, etc.
Les CPP peuvent être utilisés comme agents de transfection selon deux stratégies, impliquant soit un lien chimique (stratégie covalente), soit des interactions électrostatiques/hydrophobes (stratégie non covalente) entre le CPP et sa cargaison8,9,10,11. Bien que les deux stratégies aient montré leur efficacité dans le transfert cellulaire de plusieurs cargaisons, la compréhension du mécanisme d’internalisation par les CPP est encore controversée et l’équilibre entre les voies d’endocytose ou la pénétration directe est encore difficile à mesurer12,13. Bien qu’un ensemble d’outils et de stratégies expérimentaux soient disponibles pour aborder clairement l’implication des processus endocytaires, la translocation directe semble toutefois plus difficile à caractériser car elle implique des interactions plus discrètes avec les composants de la membrane plasmique. Les membranes biologiques sont généralement composées de nombreux composants, des phospholipides aux protéines membranaires, qui peuvent varier selon le type cellulaire et/ou l’environnement (conditions de stress, division cellulaire, etc.). Cette diversité de composition, et par conséquent l’absence d’un modèle universel de membrane cellulaire ne permet pas des études d’une seule manière. Cependant, pour contourner ces limitations, des approches étape par étape ont été développées avec des membranes artificielles ou des extraits de membrane. Des petites vésicules unilamellaires aux approches monocouches, chaque modèle était clairement pertinent pour répondre à des questions spécifiques14,15. Parmi eux, les grandes vésicules unilamellaires (LV) constituent un modèle membranaire approprié pour étudier les interactions peptide/membrane comme étant un point clé du processus d’internalisation.
Dans ce contexte, le protocole suivant décrit l’étude des effets des peptides et des interactions peptide/membrane sur l’intégrité des LV grâce à la surveillance d’un colorant fluorescent anionique et de son quencher poly-cationique correspondant encapsulé dans des liposomes. Cet outil est utilisé pour étudier les interactions CPP/membrane afin de comprendre s’ils sont capables d’effectuer une translocation membranaire directe. Bien qu’il soit généralement appliqué pour comparer différents peptides interagissant avec la membrane, ce test de fuite de fluorescence LUV pourrait également être utilisé pour étudier à la fois les conjugués CPP-cargo (stratégie covalente) et les complexes CPP:cargo (stratégie non covalente).
Le présent protocole sera donc d’abord illustré avec les peptides amphipathiques riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés16. WRAP est capable de former des nanoparticules à base de peptides pour délivrer rapidement et efficacement de petits ARN interférents (siRNA) dans plusieurs lignées cellulaires16. Les propriétés de fuite de fluorescence du peptide WRAP seul ou des nanoparticules à base de WRAP chargées de siRNA ont été surveillées pour caractériser leur mécanisme d’internalisation cellulaire. Nous avons montré que leur mécanisme d’internalisation impliquait principalement une translocation directe7. Dans un deuxième exemple, le peptide WRAP a été conjugué de manière covalente au peptide interférent protéine/protéine iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 et sa capacité à déstabiliser les membranes a été comparée dans un test de fuite de fluorescence à iCAL36 couplé à Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), un autre CPP.
Enfin, les avantages et les limites de la méthode seront discutés à la fois d’un point de vue technologique et en ce qui concerne la pertinence biologique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mL glass round-bottom flask</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A350</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extruder</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td >610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorimeter</td>
			<td >PTI Serlabo</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L glass syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >705N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabAssay Phospholipid&#160;</td>
			<td >WAKO&#160;</td>
			<td >296-63801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >liquid chromatography column</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >414902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &#181;m pore size, 25 mm diameter)</td>
			<td >Whatman</td>
			<td >800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td>
			<td >Grener Bio-One</td>
			<td >614101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >FB55924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >X1525</td>
			<td>Protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >quartz fluorescence cuvette</td>
			<td >Hellma</td>
			<td >109.004F-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rotavapor system&#160;</td>
			<td >Heidolph</td>
			<td >Z334898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sephadex G-50 resin</td>
			<td >Amersham</td>
			<td >17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium azide (NaN3)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chlorid (NaCl)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sonicator bath USC300T</td>
			<td >VWR</td>
			<td >142-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphingomyelin</td>
			<td >Avanti Polar</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Protect from air</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100&#160;</td>
			<td >Eromedex</td>
			<td >2000-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zetaziser NanoZS&#160;</td>
			<td >Malvern</td>
			<td >ZEN3500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

Les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) sont définis comme des transporteurs capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules. L’une des principales caractéristiques communes requises pour cette activité résultait des interactions des CPP avec la membrane plasmique (lipides) et plus particulièrement avec les composants de la matrice extracellulaire de la membrane elle-même (sulfate d’héparane). En effet, indépendamment de la translocation directe ou de l’internalisation dépendante de l’endocytose, les bicouches lipidiques sont impliquées dans le processus d’internalisation tant au niveau de la membrane plasmique qu’au niveau du trafic intracellulaire (vésicules endosomales). Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé décrivant les différentes étapes de la formulation, de la purification, de la caractérisation et de l’application d’une grande vésicule unilamellaire (LV) dans le test de fuite de fluorescence afin de détecter une éventuelle déstabilisation/interaction CPP-membrane et d’aborder leur rôle dans le mécanisme d’internalisation. Des LV avec une composition lipidique reflétant la teneur en membrane plasmique sont générés afin d’encapsuler à la fois un colorant fluorescent et un quencher. L’ajout de peptides dans le milieu extravésiculaire et l’induction d’interactions peptide-membrane sur les LV pourraient ainsi induire de manière dose-dépendante une augmentation significative de la fluorescence révélant une fuite. Des exemples sont fournis ici avec les peptides amphipathiques (W) riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés, qui ont montré une administration rapide et efficace de siRNA dans diverses lignées cellulaires. Enfin, la nature de ces interactions et l’affinité pour les lipides sont discutées pour comprendre et améliorer la translocation membranaire et/ou l’échappement endosomal.

Le principe du test de fuite de fluorescence est illustré à la figure 1. Dans le détail, de grandes vésicules unilamellaires (LV) encapsulant un colorant fluorescent et un quencher (pas de signal de fluorescence) sont traitées avec la biomolécule d’intérêt. En raison de l’interaction du peptide avec les membranes lipidiques, ce qui pourrait impliquer la perméabilité de la membrane, la réorganisation ou même la rupture, le colorant de fluoresce...

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Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Le test de fuite de fluorescence est une méthode simple qui permet d’enquêter sur les interactions peptide/membrane afin de comprendre leur implication dans plusieurs processus biologiques et en particulier la capacité des peptides pénétrants dans les cellules à perturber les bicouches de phospholipides lors d’un processus de translocation cellulaire directe.

Test de fuite fluorescente pour étudier la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.0K vues.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. Le test de fuite de fluorescence est une méthode simple qui permet d’enquêter sur les interactions peptide/membrane afin de comprendre leur implication dans plusieurs processus biologiques et en particulier la capacité des peptides pénétrants dans les cellules à perturber les bicouches de phospholipides lors d’un processus de translocation cellulaire directe.

Vidéo: Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Recherche

Biochimie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Manipulation facile des Architectures à base de protéines Hydrogels pour Applications de Culture de cellules

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

Analyse d’activité de l’ADN polymérase utilisant l’ADN marqué Fluorescent proche infrarouge visualisée par électrophorèse sur Gel d’Acrylamide

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Peptides de pénétration cellulaire biotinylé pour étudier les Interactions protéine-protéine intracellulaire

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trans-Plasma Membrane Transport des électrons par les Myotubes C2C12 de mesure

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Un dosage de clivage du Peptide Fluorogène pour dépister l’activité protéolytique : demandes de coronavirus doper l’activation de la protéine

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...