Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes Health NS-DK-38849 et 076160, la Juvenile Diabetes Research Foundation Center pour l&#39;étude de complications du diabète, le Programme de neurologie de recherche et de découverte et de l&#39;A. Alfred Taubman Institut de recherche médicale à la Université du Michigan. Ce travail a utilisé le Morphologie et Core Image Analysis du Centre de recherche sur le diabète du Michigan et de la formation, financée par les Instituts nationaux de la santé Grant 5P60 DK-20572 de l&#39;Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales. Les auteurs remercient Scott T. Clarke de Molecular Probes / Invitrogen pour ses précieux conseils sur les différentes Cliquez-iT EdU étiquetage des kits et le don généreux de réactifs pour soutenir le développement initial de la technique d&#39;amplification Edu.

1. Préparation de Neurones <ol><li> Dorsale racines ganglionnaires (DRG) sont cultivés sur des neurones stérile (autoclavés) 12 lamelles de verre mm dans une plaque de culture 24 bien. </li><li> Le stock de 10 mM d&#39;Edu (dans le DMSO, Cliquez-iT EdU microplaques Assay Kit) est généralement dilué à 1:100 dans un milieu de culture pour obtenir une solution EdU 10X (100 uM) puis dilué 1:10 dans les puits de culture (par exemple 30 ul de la solution EdU 10X en un total de 300 ul de milieu de culture). Neurones DRG sont incubées avec une concentration finale de 10 uM EdU à 37 ° C et 5% de CO 2 entre 2-24 heures. La longueur du temps dépend de la manière dont les traitements affectent le taux de synthèse de l&#39;ADN mitochondrial. </li><li> Dans une hotte, les neurones DRG sont fixés dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 10-15 min à température ambiante, lavées deux fois dans du PBS 1X 2-5 minutes à chaque lavage et stockées dans l&#39;eau douce du PBS 1X pour un maximum de 1 mois à 4 ° C. </li><li> Lamelles sont transférées avec une pince à pointe fine à une chambre humide préparée (plat BioAssay Corning avec fond noir pour tapissée revanche, enveloppé dans du papier aluminium pour protéger les composants sensibles de lumière et humidifié avec de l&#39;eau saturée Kimwipes) et placé sur une feuille de parafilm M qui fournit une surface hydrophobe de limiter les solutions à la lamelle. Le protocole ci-dessous est conçu pour les 28 lamelles et les solutions sont préparées pour 32 lamelles (environ un volume supplémentaire de 14%). Solutions avec des composants coûteux ou limitées sont faits de sorte que 75-80 ul sont utilisés sur chaque lamelle. Sinon, 200-300 uL sont utilisés pour des solutions de lavage et de bloquer les laver à fond les solutions précédentes. </li><li> Ré-appliquer PBS 1X pour couvrir la surface de chaque lamelle (200-300 ul). Préparer le dosage Cliquez-it et tyramide kits d&#39;amplification du signal comme décrit ci-dessous et dans les instructions du fabricant. </li></ol> Préparation de Click-iT EdU microplaques Assay Kit La plupart des composants du kit Cliquez-iT EdU Assay microplaques sont pré-faites et sont conservés à 4 ° C [2x Cliquez-iT tampon de réaction (composant E 10x), CuSO4 (100 mM, composante F), Cliquez-iT EdU fixateur ( Tampon composant D) et le blocage (Component 2x H)]. Cliquez-iT Additif Tampon Edu (Component 10x G) est stocké à -20 ° C à l&#39;empêcher de tourner jaune-brun avec le temps. Ce composant supporte répétés de gel-dégel. L&#39;Oregon Green 488 azide (volet B) devrait être divisé en petites portions (10-20 uL) pour minimiser les cycles gel-dégel et conservés à -20 ° C. Pour préparer une solution stock de conjugué anti-Oregon Green HRP (volet I), ajouter 75 ul de Milli Q dH O 2 dans le flacon. Mélanger doucement par pipetage ou par inversion pour éviter de faire mousser et stocker à 4 ° C. Ne pas vortex. Préparation de la TSA Kit N ° 12, avec HRP de chèvre anti-lapin IgG et Alexa Fluor 488 Kit tyramide Pour préparer la solution mère tyramide, dissoudre la matière solide (Alexa Fluor 488 tyramide, le composant A) dans 150 ul de DMSO (composant B). Retournez le flacon à plusieurs reprises pour dissoudre tout revêtement tyramide les côtés du flacon. Solution stock magasin en petites aliquotes (10-20 uL) à ≤ -20 ° C, desséchée et protégé de la lumière. 2. Cliquez-iT 5-éthynyl-2-désoxyuridine (EDU) Étiquetage REMARQUE: Toutes les solutions sont retirés avec une pipette de transfert ampoule avec une pointe de 200 ul apposée à la fin pour enlever délicatement les liquides sans cellules perdre. Évitez d&#39;utiliser une ligne de vide, ce qui généralement supprimer des solutions trop vigoureusement. Une pipette ampoule est utilisée pour les inondations en douceur avec des lamelles de 200 à 300 uL de solutions de lavage pour laver la solution précédente. <ol><li> Les cellules sont perméabilisées avec 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS 1X solution pendant 10 minutes à température ambiante dans une chambre couverte et humide. Utilisez 1% de Triton-X-100 solutions de stock. <ul><li> Faire 3000 ul de 0,1% de Triton-X-100 en ajoutant 300 ul 1% de Triton-X-100 d&#39;actions à 2700μL PBS 1X. </li><li> Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li></ul></li><li> Retirez le Triton X-100 solution et rincer deux fois avec du PBS 1X. </li><li> Activité peroxydase endogène est arrêtée par 1% de H 2 O 2 dans du PBS 1X solution pendant 30 minutes à température ambiante. Diluer 30% H 2 O 2 solution avec du PBS 1X. Cette solution doit être préparée, mais peuvent être faites pendant l&#39;étape de perméabilisation 10 minutes ci-dessus (étape 3.1). <ul><li> Faire 3000 ul de 1% H 2 O 2 par ajout de 100 uL 30% H 2 O 2 à 2900 ul de PBS 1X. </li><li> Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li><li> Retirer la solution de peroxydase et rincer deux fois avec du PBS 1X. </li></ul></li><li> Cliquez-iT Réaction EdU <ul><li> Pour 32 lamelles (32 x 80 uL =2560 uL) un total de 2560 uL est nécessaire. La réaction se fait en 2x 1280 ul, qui est la moitié du volume total de la réaction. </li><li> Fraîchement préparer le cocktail Réaction Cliquez-elle avant de commencer le correctif après 5 minutes (étape 3.5 ci-dessous). </li><li> Mélanger le cocktail par aspiration et refoulement. Ne pas vortexer lors de cette réaction. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 Cocktail de réaction x Les composants sont de Click-iT EdU microplaques Assay Kit </td><td> La moitié du volume: 1280 uL </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 uL </td></tr><tr><td> 2x tampon de réaction Cliquez-iT (composant E 10x) </td><td> 100,3 uL </td></tr><tr><td> Cliquez-iT Additif Tampon Edu (G Component 10x) </td><td> 25,6 uL </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mm, F Component) </td><td> 25,6 uL </td></tr><tr><td> Oregon Green azide (un composant) </td><td> 6,4 uL </td></tr><tr><td> Total des </td><td> 1290,7 uL </td></tr></tbody></table> REMARQUE: Les volumes utilisés ci-dessus sont proportionnelles aux volumes figurant dans les directions Cliquez-iT microplaques EdU trousse de dosage. Le volume final de réaction Cocktail est un peu plus de 1280 pi. </li><li> L&#39;Cliquez-iT 2X réactionnel est dilué avec un volume égal de Click-iT EdU fixateur (composant D) juste avant l&#39;utilisation. Le mélange de ces même fait une solution de réaction uniforme pour toutes les lamelles. </li><li> Ajouter 1290,7 uL Cliquez-iT EdU fixateur (composant D) pour le cocktail 1290,7 réaction ul. Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li></ul></li><li> Post-fixer les neurones avec Click-iT EdU fixateur (composant D) pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer corriger et d&#39;ajouter un cocktail réaction ci-dessus (étape 3.4). Couvrir pour protéger de la lumière et incuber pendant 25 minutes à température ambiante. Retirez délicatement le cocktail de réaction. Laver deux fois avec diluée tampon de blocage 1X (2X composante H). <ul><li> Faire 5200 ul de tampon de blocage 1X en diluant 2600 pi de tampon de blocage (2x composante H) avec un volume égal de MilliQ d H 2 O (2600 ul). Utilisez 75-80 ul par lamelle. </li></ul></li><li> Sous un microscope épi-fluorescence, vérifiez Oregon Green coloration des noyaux de cellules de contrôle mitotique active. </li></ol> 3. Amplification du signal tyramide (TSA) de Edu Signal <ol><li> Ajouter 1% d&#39;une solution à chaque bloc de TSA lamelle et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. <ul><li> Faire uL d&#39;une solution de 6000 blocs de 1% du CST en pesant 0,06 g de réactif de blocage TSA (TSA n ° 12 de kit, la composante D) et en l&#39;ajoutant à 6000 ul de PBS 1X. Vortex pour mélanger. L&#39;addition de sérum de chèvre 5% dans la solution de bloc TSA 1% sera souvent aider à réduire la liaison non spécifique. </li></ul></li><li> Centrifuger brièvement l&#39;anti-Oregon Green peroxydase de raifort d&#39;anticorps conjugués des stocks (volet I de l&#39;Assay Cliquez-iT EdU microplaques), préparé 2-24 heures à l&#39;avance de la TSA. Diluer l&#39;anticorps primaire 1:300 dans 1% TSA solution de blocage et inverser ou d&#39;une pipette de haut en bas doucement pour mélanger. Ne pas vortexer pour éviter de perturber l&#39;anticorps HRP-conjugué. Retirer solution à 1% de bloc TSA, ajouter 75 ul de chaque lamelle et incuber une nuit à 4 ° C. <ul><li> L&#39;anticorps peut être utilisé plus concentrée, comme 1:150, mais il est fourni en quantités limitées, donc l&#39;utiliser avec parcimonie. Encore une fois, l&#39;ajout de sérum de chèvre 5% dans la solution de bloc TSA 1% sera souvent aider à réduire la liaison non spécifique de l&#39;anticorps anti-peroxydase de raifort Oregon Green conjugués. </li><li> Faire 2560 ul d&#39;une solution d&#39;anticorps 1:300 en ajoutant 8,53 uL du Lapin stock de lutte contre l&#39;Oregon Green-HRP (Cliquez-iT EdU microplaques Assay) pour 2560 uL 1% Blocage TSA. Mélanger à la pipette doux ou inversion. </li></ul></li><li> Le lendemain, retirez la solution d&#39;anticorps et rincer trois fois avec du PBS 1X. Incuber les lamelles dans le lavage final pour un 30-60 minutes supplémentaires à température ambiante afin d&#39;assurer que les anticorps primaires non liés est enlevé. </li><li> Préparer la réaction tyramide pour 2560 uL (32 x 80 lamelles uL). <ul><li> Faire 400 ul d&#39;un 0,15% H 2 O 2 solution (100X) en ajoutant 2 ul de 30% H 2 O 2 (TSA kit n ° 12, Composant F) à 398 uL tampon d&#39;amplification (TSA n ° 12 de kit, composant E) . Cela devrait être fait juste avant nécessaire. </li><li> Pour un volume final de 2560 uL combiner: <ul><li> 25,6 tyramide-488 uL (TSA Kit Volet A) </li><li> 2508,8 tampon d&#39;amplification uL (E TSA composant du kit) </li><li> 25,6 uL 0,15% H 2 O 2 (ci-dessus pour une finale de 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Retirer du PBS 1X et incuber avec la réaction tyramide pendant 15 minutes à température ambiante. </li></ul></li></ul></li><li> Retirez la réaction tyramide et rincer trois fois avec du PBS 1X, l&#39;incubation dans le lavage final pendant 30-60 minutes à température ambiante comme avant. </li><li> Vérifier l&#39;ADNmt étiquetage sous un microscope épi-fluorescence. <ul><li> Mont lamelles sur des lames de microscope en verre avec un milieu de montage Antifade, comme Prolongez l&#39;or avec le DAPI. Alternativement, l&#39;étiquetage et l&#39;amplification EdU peut être suivie par immunocytochimie fluorescents standards pour étiqueter les autres marqueurs cellulaires. </li></ul></li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Visualisation de la réplication d&#39;ADN mitochondrial comme marqueur de la biogenèse mitochondriale Nous nous intéressons à la manière dont les neurones sensoriels (figure 1) réguler le nombre de mitochondries. Ce protocole d&#39;étiquettes ADNmt nouvellement synthétisées avec un marqueur fluorescent comme un moyen de mesurer de nouvelles mitochondries. L&#39;incorporation de l&#39;EDU nucléotidique synthétique suivie par la chimie clic de l&#39;amplification Oregon Green-azide et ultérieures avec les 488 Alexa-Fluor résultats tyramide dans l&#39;étiquetage de l&#39;ADNmt avec un signal de fluorescence verte (figure 2). Si fait correctement, le signal amplifié vert est suffisamment supérieure à la fluorescence de fond (tels que l&#39;autofluorescence cellulaire ou un effet secondaire de la réaction HRP-TSA). Cette technique est conçue pour l&#39;étiquette ADNmt nouvellement répliqué afin de visualiser et de quantifier l&#39;ADNmt au sein de la biogenèse des compartiments subcellulaires de neurones (figure 3). L&#39;étiquetage permet d&#39;immunocytochimie EdU fluorescentes à la suite de l&#39;étiquette d&#39;autres marqueurs cellulaires tels que des neurofilaments (figure 3D). La réaction du CST peut aussi être fait avec d&#39;autres fluorescents Alexa Fluor tyramides comme Alexa Fluor 594-tyramide. Il en résulte un signal vert fluo nucléaires de la réaction Orégon cliquez vert-azoture dans le noyau, mais aucun signal vert dans l&#39;ADNmt, qui est indétectable avant la TSA. L&#39;amplification avec Alexa Fluor 594-tyramide intensifie l&#39;étiquette nucléaire et révèle l&#39;EDU incorporé dans l&#39;ADN mitochondrial avec un signal fluorescent rouge (figure 4). Une procédure d&#39;amplification similaire est utilisé pour visualiser l&#39;incorporation de BrdU dans l&#39;ADN mitochondrial nouvellement synthétisées (figure 5), cependant, cette méthode nécessite une étape supplémentaire pour récupérer l&#39;épitope BrdU soit par un acide sévère (HCl) ou de l&#39;enzyme digérer, ce qui n&#39;est pas nécessaire pour Edu l&#39;étiquetage. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentant contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) des images d&#39;embryons (à gauche) et adulte (à droite) ganglion de la racine dorsale (DRG) les neurones qui sont généralement utilisés pour l&#39;analyse. Bars = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma représentant la procédure à suivre pour l&#39;étiquetage EdU l&#39;ADNmt avec un signal fluorescent vert. Le schéma représente le protocole en trois étapes pour l&#39;étiquetage EdU l&#39;ADNmt avec un signal fluorescent vert. Mitotiquement actives F11 cellules de neuroblastome servir de contrôle positif et d&#39;illustrer le modèle d&#39;étiquetage des EdU qui a été incorporé dans l&#39;ADN nucléaire et mitochondrial. La première étape (P1) est d&#39;incorporer un analogue de la thymidine dans l&#39;ADN mitochondrial nouvellement synthétisées par des cellules d&#39;incubation en présence de Edu. La deuxième étape (P2) est basée sur la chimie de cliquer à l&#39;étiquette EdU incorporé avec une Oregon Green-azoture. Signal vert est visible dans les noyaux des cellules qui reproduit leur ADN nucléaire. L&#39;étape finale (P3) est d&#39;amplifier le Gr. Orégoneen-azoture de signal par incubation avec un anticorps de lapin HRP-conjugué contre Oregon Green suivie d&#39;une incubation avec Alexa Fluor 488 tyramide marqué en présence de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pour visualiser le signal vert dans l&#39;ADNmt. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. EdU étiquetage de l&#39;ADNmt dans le ganglion de la racine dorsale (DRG) les neurones. Neurones sont incubées avec Edu et le signal est ensuite amplifié à révéler l&#39;ADNmt qui incorporait Edu. Représentant des images de fluorescence superposée sur la lumière transmise montrant verte ponctuée de signaux amplifiés EDU (EDU-OG-TSA, vert) incorporé dans l&#39;ADN mitochondrial des deux nouvellement synthétisées embryonnaires (A) et adulte (BD) neurones DRG. La procédure d&#39;étiquetage EdU permet immunofluorescence ultérieure des marqueurs neuronaux tels que neurofilaments (D, αNF, en rouge). Barres d&#39;échelle = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Schéma représentant la procédure à suivre pour l&#39;étiquetage EdU l&#39;ADNmt avec un signal rouge fluorescent. Le schéma représente le protocole en trois étapes pour l&#39;étiquetage EdU l&#39;ADNmt avec un signal rouge fluorescent. Mitotiquement actives F11 cellules de neuroblastome servir de contrôle positif et d&#39;illustrer le modèle d&#39;étiquetage des EdU qui a été incorporé dans l&#39;ADN nucléaire et mitochondrial. La première étape (P1) est d&#39;incorporer un analogue de la thymidine dans l&#39;ADN mitochondrial nouvellement synthétisées par des cellules d&#39;incubation en présence de Edu. La deuxième étape (P2) est basée sur la chimie de cliquer à l&#39;étiquette EdU incorporé avec une Oregon Green-azoture. Signal vert est visible dans les noyaux des cellules qui reproduit leur ADN nucléaire. L&#39;étape finale (P3) est d&#39;amplifier l&#39;Oregon Green-azoture de signal par incubation avec un anticorps de lapin HRP-conjugué contre Oregon Green suivie d&#39;une incubation avec Alexa Fluor 594 tyramide marqué en présence de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pour visualiser signal rouge de l&#39;ADNmt. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. BrdU étiquetage et l&#39;amplification du signal avec un signal tyramide vert ou rouge fluorescent dans l&#39;ADNmt. Le schéma représente la procédure de marquage BrdU dans l&#39;ADN mitochondrial nouvellement synthétisées avec soit un signal vert ou rouge fluorescent. Une première étape est nécessaire pour récupérer l&#39;épitope BrdU soit par un acide (HCl) ou de l&#39;enzyme digérer, ce qui n&#39;est pas nécessaire pour l&#39;étiquetage Edu. La prochaine étape est l&#39;incubation avec une souris primaires d&#39;anticorps anti-BrdU. Il est suivi par une incubation avec une peroxydase de raifort (HRP) de chèvre conjugué anticorps anti-souris. Enfin, le signal est amplifié avec un tyramide vert ou rouge marqué par fluorescence, en présence de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pour visualiser les signaux dans l&#39;ADN mitochondrial.

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+[(3)H]thymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations.">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li><li>Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels.">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Ethynyl-2'-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea.">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

Nous avons développé un test sensible à l&#39;étiquette ADNmt nouvellement synthétisés dans des cellules individuelles en utilisant une amplification du signal tyramide d&#39;Edu. Un des plus gros problèmes lors de l&#39;optimisation de ce protocole a été le résultats incohérents entre les lamelles. Des changements ont été apportés aux protocoles Invitrogen kit pour éviter de mélanger de petits volumes sur des lamelles individuelles et l&#39;élaboration de solutions maître à utiliser pour toutes les lamelles. Les 75-80 uL utilisé pour chaque lamelle de verre de 12 mm circulaire est un volume idéal pour couvrir complètement la surface tout en fournissant suffisamment de solution pour donner des résultats cohérents entre les échantillons. Des temps d&#39;incubation et de concentrations de réactifs ont été optimisés, mais des améliorations pourraient être vus avec des ajustements pour eux. Le protocole est conçu pour fonctionner à chaque processus une fois. Cependant, certaines étapes ont été répétées avec de nouvelles solutions pour récupérer des échantillons qui ont échoué après la première tentative. En particulier, les étapes de réaction EdU clic (03/04 au 03/06) ont été répétés sans une augmentation significative de la fluorescence de fond. L&#39;incubation d&#39;anticorps anti-Oregon Green-HRP (04/01 au 04/03) et l&#39;amplification tyramide (04/04 au 04/05) des mesures ont également été répété, mais le plus souvent traduit par un mauvais signal à bruit en raison de la fluorescence de fond accrue. Les réactifs les plus sensibles sont les additifs Cliquez-iT Tampon Edu (Component G) et le lapin anti-Oregon Green-HRP anticorps (volet I) à partir du kit Cliquez-iT EdU Assay microplaques. L&#39;additif Cliquez-iT Tampon EdU tourne progressivement au fil du temps jaune lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C et entre 6-12 mois s&#39;assombrit considérablement. Stockage de l&#39;additif Cliquez-iT Tampon EdU à -20 ° C permettra d&#39;atténuer ce problème. L&#39;étiquetage et les étapes d&#39;amplification tyramide meilleur travail quand le lapin anti-Oregon Green-HRP anticorps est utilisé dans les 4-6 mois de la reconstituer dans MilliQ dH 2 O. L&#39;étiquetage légère de l&#39;ADNmt EdU permet des comparaisons directes avec d&#39;autres marqueurs cellulaires 9-11 et améliore l&#39;utilité de cette technique par rapport à d&#39;autres analogues de la thymidine, tels que le 5-bromo-2-désoxyuridine (BrdU), ce qui nécessite un traitement sévère pour récupérer son épitope dans l&#39;ADN. Notre laboratoire 11-12 et 13-15 autres ont utilisé avec succès BrdU pour étiqueter l&#39;ADNmt. La technique de marquage BrdU est similaire à celui utilisé pour Edu, mais a quelques différences importantes (figure 5). Après l&#39;étape de perméabilisation énumérés ci-dessus (3.1 à 3.2), l&#39;épitope BrdU est récupéré avec une étape de dénaturation (2 HCl pendant 30 min à 37 ° C suivie de trois lavages en PBS 1X). La BrdU est ensuite marqué avec un anticorps primaire contre le BrdU (Vector Laboratories dilué à 1:50 dans une solution de 1% le blocage de la trousse de TSA et incubée une nuit à 4 ° C). Une étape anticorps secondaire est nécessaire pour amplifier le signal BrdU (chèvre anti-IgG de souris conjugué à la HRP de la TSA trousses # 2 et # 5, dilué à 1:100 dans une solution à 1% de blocage et incubées pendant 45 min à température ambiante) avant les étapes TSA (4.3 à 4.5 ci-dessus). Avoir deux analogues de la thymidine, Edu et BrdU, d&#39;ADNmt étiquette est avantageux pour réaliser des expériences où l&#39;ADNmt étiquette double peut être étiqueté de manière séquentielle impulsion étiquetage paradigmes 11. Notre laboratoire est à l&#39;aide de l&#39;UDE et marquage au BrdU de l&#39;ADNmt d&#39;examiner la réglementation de la biogenèse mitochondriale dans le cadre de la neuropathie diabétique, une complication fréquente du diabète. Nous avons utilisé avec succès l&#39;amplification du signal pour mesurer les changements dans l&#39;ADN mitochondrial dans la biogenèse des neurones individuels 11-12. Cette technique sera utile dans d&#39;autres expériences visant à explorer les mécanismes de réplication de l&#39;ADNmt et le chiffre d&#39;affaires ou pour identifier les médicaments qui inhibent la synthèse ADNmt. En outre, les principes de base des signaux de Edu et BrdU amplifiant peut être appliquée à d&#39;autres études qui mesurent la réplication d&#39;ADN ou de réparation.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

Les mitochondries sont des régulateurs clés de l&#39;énergie cellulaire et la biogenèse mitochondriale est un élément essentiel de régulation de numéros de mitochondries dans les cellules saines 1-3. Une approche pour le suivi biogenèse mitochondriale est de mesurer le taux d&#39;ADN mitochondrial (ADNmt) réplication 4. Nous avons développé une technique sensible à l&#39;étiquette ADNmt nouvellement synthétisés dans des cellules individuelles, afin d&#39;étudier la biogenèse ADNmt. La technique combine l&#39;incorporation de 5-éthynyl-2&#39;-désoxyuridine (EDU) 5-7 avec une amplification du signal tyramide (TSA) 8 du protocole de visualiser la réplication au sein de l&#39;ADNmt compartiments subcellulaires des neurones. Edu est supérieur à d&#39;autres analogues de la thymidine, tels que le 5-bromo-2-désoxyuridine (BrdU), parce que la réaction initiale de cliquer à Edu étiquette 5-7 n&#39;exige pas que le traitement à l&#39;acide ou de dures enzyme digère qui sont nécessaires pour exposer l&#39;épitope BrdU . Le plus doux étiquetage des EdU permet la comparaison directe de son incorporation à d&#39;autres marqueurs cellulaires 9-10. La capacité de visualiser et de quantifier l&#39;ADNmt biogenèse fournit un outil essentiel pour étudier les mécanismes utilisés pour réguler la biogenèse mitochondriale et donnerait un aperçu de la pathogenèse associée à la toxicité des médicaments, du vieillissement, le cancer et les maladies neurodégénératives. Notre technique est applicable pour les neurones sensoriels ainsi que d&#39;autres types cellulaires. L&#39;utilisation de cette technique pour mesurer la biogenèse ADNmt a des implications importantes dans la poursuite de la compréhension de la physiologie normale à la fois cellulaire ainsi que les états pathologiques d&#39;ébriété.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Nous avons développé une technique sensible à l&#39;étiquette nouvellement synthétisés d&#39;ADN mitochondrial (ADNmt) dans des cellules individuelles, afin d&#39;étudier la biogenèse ADNmt. La technique combine l&#39;incorporation de EdU avec une amplification du signal tyramide (CST) du protocole de visualiser la réplication au sein de l&#39;ADNmt compartiments subcellulaires des neurones.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN mitochondrial dans des cellules individuelles par amplification du signal EdU

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K vues.  University of Michigan. Nous avons développé une technique sensible à l'étiquette nouvellement synthétisés d'ADN mitochondrial (ADNmt) dans des cellules individuelles, afin d'étudier la biogenèse ADNmt. La technique combine l'incorporation de EdU avec une amplification du signal tyramide (CST) du protocole de visualiser la réplication au sein de l'ADNmt compartiments subcellulaires des neurones.

Vidéo: Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Lecture automatique Interactive Video pour les études de la communication animale

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Recherche

Neurosciences

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Évaluation de la Fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualisation des Modules corticales dans cortex mammifère aplatie

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.