Ce travail a été soutenu par la bourse de recherche de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), la subvention de recherche de la Fondation Shurl et Kay Curci (S.C.), la subvention Merkin Innovation Seed (S.C.), la subvention de recherche Mallinckrodt (S.C.) et la bourse Margaret E. Subvention Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. est également soutenu par le NIH/NCI sous le numéro de bourse P30CA016042.

1. Marquage des protéines dans les cellules
<ol><li>Exprimer la protéine d’intérêt fusionnée à HaloTag dans la lignée cellulaire souhaitée.</li>
	<li>Exprimer de manière stable H2B marqué Halo dans le même type de cellules que dans 1.1 en utilisant des transposons ou une transduction virale.</li>
</ol>2. Préparation des lamelles
<ol><li>Avant d’utiliser des lamelles pour la culture cellulaire, nettoyez-les pour éliminer les contaminants autofluorescents.<ol><li>Montez les lamelles de 25 mm de diamètre, #1.5 sur un support de coloration en céramique et placez-les dans un récipient en polypropylène.</li>
		<li>Immerger complètement les lamelles dans une solution de KOH à 1 M et de sonicate pendant 1 h.</li>
		<li>Rincer trois fois les lamelles avec de l’eau doublement distillée (jjdH2O).</li>
		<li>Immerger complètement les lamelles dans de l’éthanol à 100 % et du sonicate pendant 1 h.</li>
		<li>Immerger complètement les lamelles dans de l’éthanol à 20 % dilué avec du jdH2O et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Préparation des cellules pour la microscopie
REMARQUE : Effectuez les étapes de cette section dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination des cellules.
<ol><li>Plaquez les cellules sur les lamelles nettoyées. Effectuer 2 jours avant l’imagerie si la protéine marquée Halo doit être exprimée transitoirement. Effectuer 1 jour avant l’imagerie si la protéine marquée Halo est exprimée de manière stable ou endogène.<ol><li>Utiliser une pince stérile pour placer les lamelles dans une plaque à 6 puits (une lamelle/puits par échantillon de cellule) et laisser l’éthanol résiduel s’évaporer.</li>
		<li>Plaquez chaque puits avec un nombre approprié de cellules pour atteindre une confluence de 70 % au moment de l’imagerie. Plaquez un puits supplémentaire avec des cellules exprimant de manière stable H2B-Halo avec la même confluence cible.</li>
		<li>Suivez cette étape uniquement si vous exprimez transitoirement la protéine d’intérêt marquée Halo. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2. Ensuite, transfectez les cellules avec le plasmide codant pour la protéine d’intérêt marquée à l’aide de réactifs de transfection appropriés et en suivant les directives du fabricant.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorer les cellules exprimant la protéine d’intérêt marquée Halo avec un ligand Halo non photoactivable (par exemple, JFX549) et un ligand Halo photoactivable (par exemple, PA-JF646). Cellules de coloration exprimant H2B-Halo avec uniquement le ligand photoactivable Halo. REMARQUE : Les concentrations de ligands Halo énumérées ici doivent être utilisées comme point de départ ; La concentration optimale dépendra du niveau d’expression et de la concentration locale dans le condensat de la protéine d’intérêt.<ol><li>Pour chaque échantillon cellulaire exprimant la protéine d’intérêt marquée Halo, diluer 100 nM JFX549 Haloligand 35 et 20 nM PA-JF646 Haloligand 36 dans 500 μL de milieu cellulaire approprié. Pour chaque échantillon exprimant H2B-Halo, diluer seulement 20 nM de ligand PA-JF646 Halo dans 500 μL de milieu cellulaire approprié.</li>
		<li>Pour chaque puits, aspirer les milieux existants, ajouter 2 mL de 1x PBS, puis aspirer le PBS (c’est ce qu’on appelle un « rinçage » pour le reste du protocole) et remplacer par des milieux contenant les ligands Halo appropriés.</li>
		<li>Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Rincer avec du PBS quatre fois et remplacer par un milieu frais ne contenant pas de ligands Halo.</li>
		<li>Incuber pendant 15 min à 37 °C et 5% de CO2.</li>
		<li>Répéter les étapes 3.2.4 et 3.2.5 trois fois (quatre cycles de rinçage-incubation au total).</li>
		<li>Utilisez une pince stérile pour transférer la lamelle avec les cellules dans une chambre de lamelle de culture cellulaire compatible avec la platine du microscope.</li>
		<li>Ajouter un milieu sans rouge de phénol dans la chambre et procéder à l’imagerie. Incuber les échantillons sans les imager immédiatement à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à ce que cela soit nécessaire.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imagerie monomoléculaire
REMARQUE : Des expériences indépendantes mesurant les temps de séjour de H2B et de la protéine d’intérêt doivent être menées sur plusieurs (≥3) jours pour générer des résultats statistiquement significatifs. Avant d’imager des échantillons de cellules au microscope, alignez les deux caméras à l’aide de microsphères colorées de 0,1 μm (Table des matériaux) ou d’un étalon d’étalonnage similaire.
<ol><li>Préparez le microscope.<ol><li>Allumez le microscope et l’ordinateur qui le contrôle.</li>
		<li>Allumez les composants d’incubation des cellules vivantes (chauffage et CO2) sur le microscope et réglez-le à 37 °C et 5 % de CO2. Laissez le système s’équilibrer.</li>
		<li>Mettez une goutte d’huile appropriée sur un objectif à immersion dans l’huile TIRF 100x sur le microscope et chargez l’échantillon de cellule sur la platine du microscope.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifiez une cellule à imager.<ol><li>Imagez l’échantillon de cellule sous un éclairage en fond clair et ajustez la position z jusqu’à ce que les cellules soient nettes.</li>
		<li>Identifier une cellule qui présente les caractéristiques morphologiques des cellules saines.</li>
		<li>Recadrez le champ de vision (FOV) afin qu’il ne capture que le noyau de la cellule cible.</li>
		<li>Utilisez l’éclairage laser et ajustez l’angle TIRF jusqu’à ce que l’éclairage HILO41 avec un rapport signal/bruit optimal des molécules individuelles soit atteint.</li>
	</ol></li>
	<li>Image H2B-Halo dans des cellules vivantes. REMARQUE : Les puissances laser utilisées dans cette section sont spécifiques à cette expérience et incluses à titre d’exemple. Les puissances laser appropriées doivent être choisies en fonction des critères énumérés dans la discussion.<ol><li>Configurez une configuration d’acquisition comme suit. Réglez le temps d’exposition sur 500 ms. Au cours de chaque exposition de 500 ms, excitez les molécules H2B-Halo marquées PA-JF646 avec un faisceau de 9,1 mW, 640 nm. Pendant le temps mort entre les images (158,01 μs sur le système d’imagerie utilisé ici), photoactivez les molécules avec un faisceau de 111 μW, 405 nm.</li>
		<li>Capturez 2000 images en continu avec ces paramètres. Augmenter progressivement la puissance du faisceau de 405 nm au cours de l’acquisition lorsque le nombre de molécules photoactivées devient insuffisant.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagez la protéine d’intérêt marquée Halo dans les cellules vivantes.<ol><li>Utilisez un miroir dichroïque passe-long pour répartir les longueurs d’onde d’émission entre deux caméras, l’une pour détecter PA-JF646 et l’autre pour détecter JFX549. Utilisez des filtres d’émission appropriés devant les caméras.</li>
		<li>Utilisez la même configuration d’acquisition décrite dans la version 4.3.1 avec la modification suivante. Ajoutez un canal JFX549 supplémentaire pour suivre l’emplacement des condensats de protéines marqués Halo au fil du temps. Toutes les 10 s, acquérir une trame (500 ms, 2,1 mW, excitation 561 nm) dans le canal JFX549 tout en conservant l’acquisition du canal PA-JF646. Cela provoquera un saignement dans le canal PA-JF646, qui sera pris en charge dans l’analyse des données post-acquisition.</li>
		<li>Capturez 2000 images en continu avec ces paramètres. Augmenter progressivement la puissance du faisceau de 405 nm au cours de l’acquisition lorsque le nombre de molécules photoactivées devient insuffisant.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse des données d’imagerie de molécules uniques
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans la section 5 sont spécifiques à cette expérience et inclus à titre d’exemple. Les paramètres appropriés doivent être choisis en fonction des critères énumérés dans la discussion.
<ol><li>Préparez les données d’imagerie brutes pour le traitement.<ol><li>Pour les données de la protéine d’intérêt, convertissez chaque canal du fichier de données d’imagerie brutes en un fichier .tif indépendant à l’aide d’ImageJ ou d’un logiciel de traitement d’image similaire. Pour les données de H2B, convertissez le canal unique du fichier de données d’imagerie brutes en un fichier .tif de la même manière. REMARQUE : Selon le logiciel d’acquisition utilisé, il peut y avoir des images vides dans le film condensat, car une seule image de suivi des condensats est prise toutes les 10 s. Les images vides doivent être remplies avec la trame condensée la plus récente (certains logiciels d’acquisition le font automatiquement). De plus, s’il y a un écoulement important du canal de condensat (JFX549) vers le canal de monomolécule (PA-JF646) pendant ces trames de suivi de condensat, les trames de monomolécule correspondantes doivent être remplacées par la trame de monomolécule la plus récente.</li>
		<li>Si des images doivent être remplacées dans l’une ou l’autre des séquences pour les raisons ci-dessus, remplacez-les par l’image la plus récente de cette séquence en modifiant (si nécessaire) et en exécutant pretracking_comb.txt, une macro ImageJ disponible dans Chong et al.1, et en suivant les invites.</li>
	</ol></li>
	<li>Générer des trajectoires de particules uniques à l’aide d’un logiciel SPT, par exemple SLIMfast39, une implémentation graphique de l’algorithme MTT38 disponible dans Teves et al.42.<ol><li>Chargez le fichier de la version 5.1.2 contenant le film monomolécule dans SLIMfast en cliquant sur Charger > Imagestack.</li>
		<li>Définissez les paramètres (taux d’erreur de localisation : 10-6 ; boucles de déflation : 3) pour la localisation en cliquant sur OPT > Feuille : Localisation.</li>
		<li>Définissez les paramètres (pic d’émission : 664 nm ; temps de latence : 500 ms) pour l’acquisition en cliquant sur OPT > Feuille : Acquisition.</li>
		<li>Visualisez les localisations de toutes les molécules dans un seul cadre pour vous assurer que les paramètres choisis sont appropriés (TEST LOC). Si cela n’est pas approprié, modifiez les paramètres aux étapes 5.2.2 et 5.2.3 et répétez cette étape.</li>
		<li>Générez un fichier contenant les localisations de toutes les molécules dans chaque image (LOC ALL).</li>
		<li>Chargez le fichier à partir de la version 5.2.5 dans SLIMfast en cliquant sur Charger > données de particules > SLIMfast.</li>
		<li>Définissez les paramètres (coefficient de diffusion maximal attendu : 0,1 μm2/s ; nombre maximum de concurrents : 5) pour la génération de trajectoires en cliquant sur OPT > Feuille : Suivi.</li>
		<li>Générer un fichier contenant les trajectoires de toutes les molécules (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrer les trajectoires plus courtes que tmin, 2,5 s, à l’aide de evalSPT39, disponible dans Drosopoulos et al.43, pour tenir compte des erreurs de suivi qui entraînent des trajectoires artificiellement courtes.<ol><li>Chargez le fichier de la version 5.2.8 dans evalSPT (+ fichier > de la version 5.2.8 > OK).</li>
		<li>Définissez les paramètres (min : 5 images ; max : longueur maximale de la trajectoire pour le fichier à partir de la version 5.2.8) pour filtrer les trajectoires inférieures à 2,5 s.</li>
		<li>Générez un fichier avec toutes les trajectoires filtrées (EXPORTER LES DONNÉES).</li>
	</ol></li>
	<li>Suivez cette étape pour les trajectoires de la protéine d’intérêt uniquement. Triez les trajectoires entre celles dans les condensats et celles hors des condensats, puis extrayez le temps moyen de séjour dans les condensats. REMARQUE : Tous les codes de cette section sont disponibles dans Chong et al.1.<ol><li>Seuilz toutes les images de la vidéo acquises dans le canal JFX549 pour générer une vidéo time-lapse remplie du masque binaire évolutif dans le temps mettant en évidence les emplacements des condensats en exécutant les mask_v2.txt macro, noyau et cluster ImageJ et en suivant les invites.</li>
		<li>Reformater les trajectoires d’une seule molécule générées en 5.3.3. en utilisant le script MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, et en ajustant les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire. (Paramètres : exposition, 0,5 s ; Résolution, 0,16 μm/pixel).</li>
		<li>Triez les trajectoires en fonction de la fraction de la durée de vie d’une molécule donnée dans un condensat, F, à l’aide du script MATLAB, categorization_v4.m, et ajustez les noms de fichiers et les chemins si nécessaire.</li>
		<li>Procédez en utilisant uniquement des trajectoires dans les condensats.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraire kobs,s et kpb et calculer le temps de séjour moyen corrigé, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>Extrayez kobs,s des trajectoires de la protéine dans le condensat d’intérêt à l’aide du script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, et en ajustant les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire. (Paramètres : exposition, 0,5 s ; StartFrameForFit, 5 images).</li>
		<li>Extrayez kpb des trajectoires H2B à l’aide du script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, et ajustez les noms de fichiers, les chemins et les paramètres si nécessaire. (Paramètres : exposition, 0,5 s ; StartFrameForFit, 5 images).</li>
		<li>Calculer le temps de séjour moyen corrigé de la protéine d’intérêt spécifiquement liée à ses condensats, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">comme , <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> REMARQUE : Des contrôles doivent être effectués pour vérifier que différents temps d’exposition suffisamment longs pour brouiller les particules mobiles, par exemple 300 ms et 800 ms, entraînent toujours le même temps de séjour moyen de la protéine d’intérêt.</li>
	</ol></li>
</ol>

Quantification des interactions protéiques basée sur l’imagerie d’une seule molécule vivante

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole tel que présenté ici est conçu pour des systèmes tels que ceux étudiés dans Irgen-Gioro et al.40. Selon l’application, certains éléments du protocole peuvent être modifiés, par exemple, la méthode de génération de lignées cellulaires marquées par fluorescence, le système de marquage fluorescent et le style de lamelle utilisé. Le halomarquage d’une protéine dans une cellule peut être effectué à l’aide de deux stratégies, selon celle qui convient le mieux à ...

De plus en plus de travaux suggèrent que les condensats biomoléculaires jouent un rôle important dans l’organisation cellulaire et de nombreuses fonctions cellulaires, par exemple, la régulation transcriptionnelle 1,2,3,4,5, la réparation des dommages à l’ADN 6,7,8, l’organisation de la chromatine 9,10,11,12, le chromosome X inactivation 13,14,15 et signalisation intracellulaire 16,17,18. De plus, la dérégulation des condensats biomoléculaires est impliquée dans de nombreuses maladies, notamment les cancers 19,20,21 et les troubles neurodégénératifs 22,23,24,25,26. La formation de condensats est souvent due à des interactions transitoires, sélectives et multivalentes protéine-protéine, protéine-acide nucléique ou acide nucléique-acide nucléique27. Dans certaines conditions, ces interactions peuvent conduire à une séparation de phase liquide-liquide (LLPS), une transition de densité qui enrichit localement des biomolécules spécifiques dans des gouttelettes sans membrane. De telles interactions multivalentes sont souvent médiées par les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) des protéines 1,28,29. La caractérisation biophysique de ces interactions au niveau moléculaire est essentielle à notre compréhension de nombreuses fonctions cellulaires saines et aberrantes, étant donné l’omniprésence des condensats à travers elles. Bien que les techniques basées sur la microscopie confocale à fluorescence, par exemple la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)30,31,32, aient été largement utilisées pour montrer qualitativement que les échanges moléculaires entre les condensats et l’environnement cellulaire environnant sont dynamiques, la quantification de la dynamique d’interaction de biomolécules spécifiques dans les condensats n’est généralement pas possible à l’aide de la microscopie confocale conventionnelle ou de la monomolécule microscopie sans méthodes d’analyse de données spécialisées. La technique de suivi des particules uniques (SPT) décrite dans ce protocole est basée sur la microscopie à molécule unique sur cellules vivantes33 et fournit un outil particulièrement puissant pour quantifier la dynamique d’interaction entre des protéines spécifiques dans les condensats. La lecture de SPT pour une telle mesure est le temps de séjour moyen d’une protéine d’intérêt dans les condensats.
Le protocole peut être décomposé en deux parties : l’acquisition et l’analyse des données. La première étape de l’acquisition de données d’imagerie consiste à exprimer dans les cellules une protéine d’intérêt qui est fusionnée à un HaloTag34. Cela permet de marquer la protéine d’intérêt avec deux fluorophores, où la majorité des molécules de protéines doivent être marquées avec un fluorophore non photoactivable (par exemple, JFX549 Haloligand 35) et une petite fraction d’entre elles doit être marquée avec un fluorophore photoactivable spectralement distinct (par exemple, PA-JF646 Haloligand 36). Cela permet l’acquisition simultanée de tous les emplacements des condensats dans la cellule et l’acquisition de films monomoléculaires de la protéine d’intérêt se liant et se dissociant aux condensats. Pendant ce temps, le même type de cellules est modifié pour exprimer de manière stable H2B marquée par Halo, une histone qui est en grande partie immobile sur la chromatine. Les cellules sont ensuite colorées avec le ligand PA-JF646 Halo pour permettre l’imagerie monomoléculaire de H2B. Comme nous le verrons en détail ci-dessous, cette expérience rend compte de l’apport du photoblanchiment pour permettre une quantification précise de la dynamique d’interaction de la protéine d’intérêt. Les cellules destinées aux expériences d’imagerie doivent ensuite être cultivées sur des lamelles propres, colorées avec un ou plusieurs ligands HaloTag et assemblées dans une chambre d’imagerie de cellules vivantes. À partir de là, l’échantillon est imagé sous un éclairage à feuille optique laminée et très inclinée (HILO) sur un microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) capable d’imagerie à deux canaux et de détection de molécules uniques. L’émission est ensuite divisée sur deux caméras, l’une suivant les positions des condensats et l’autre les molécules individuelles. L’acquisition est réalisée avec un temps d’intégration long (de l’ordre de centaines de ms) pour brouiller les protéines à diffusion libre et ne capturer que les protéines moins mobiles en raison de leur liaison à des structures stables dans la cellule37.
La première étape de l’analyse des données consiste à utiliser un algorithme de suivi des particules uniques (SPT)38,39 pour localiser les molécules de protéines individuelles dans chaque image du film et assembler les localisations en une trajectoire pour chaque molécule au cours de sa durée de vie détectable. Les trajectoires sont ensuite triées en celles représentant les molécules à l’intérieur et celles représentant les molécules à l’extérieur des condensats en comparant les localisations des molécules tout au long de leurs trajectoires aux localisations de tous les condensats aux temps correspondants1.
Ensuite, une courbe de survie (1 - CDF) est générée en utilisant les longueurs de toutes les trajectoires dans les condensats. Le temps de séjour moyen apparent des molécules est ensuite extrait en ajustant la courbe de survie au modèle exponentiel à deux composantes suivant de liaison aux protéines,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
avec A comme fraction de molécules non spécifiquement liées et avec kobs,ns et kobs,s comme taux de dissociation observés des molécules non spécifiquement liées et spécifiquement liées, respectivement. Seul kobs,s est considéré à partir de maintenant. La dynamique de la dissociation des protéines, ktrue,s, et du photoblanchiment du fluorophore, kpb, contribue à kobs,s comme
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
ainsi, pour isoler les effets de la dissociation des protéines, le taux de dissociation spécifique de H2B-Halo dans la lignée cellulaire mentionnée précédemment est mesuré.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B est une protéine qui est intégrée de manière stable dans la chromatine et qui subit une dissociation minimale dans l’échelle de temps d’acquisition d’un film à molécule unique37. Son taux de dissociation spécifique est alors égal au taux de photoblanchiment du ligand PA-JF646 Halo, ou
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
Le temps de séjour moyen dans le condensat de la protéine d’intérêt, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, est alors
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Les résultats représentatifs d’Irgen-Gioro et al.40 sont présentés, où ce protocole a été appliqué pour démontrer que la fusion d’un domaine d’oligomérisation à l’IDR entraîne des temps de séjour plus longs de l’IDR dans ses condensats. Ce résultat suggère que le domaine d’oligomérisation ajouté stabilise les interactions homotypiques de l’IDR qui pilote les LLPS. En principe, la même méthode avec des protocoles légèrement modifiés peut être appliquée pour caractériser les interactions homotypiques ou hétérotypiques de toute protéine qui participe à la formation de tout type de condensats.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

Les condensats biomoléculaires formés par séparation de phase liquide-liquide (LLPS) ont été considérés comme essentiels à l’organisation cellulaire et à un nombre croissant de fonctions cellulaires. La caractérisation des LLPS dans les cellules vivantes est également importante car la condensation aberrante a été liée à de nombreuses maladies, notamment les cancers et les troubles neurodégénératifs. La LLPS est souvent pilotée par des interactions sélectives, transitoires et multivalentes entre des protéines intrinsèquement désordonnées. La dynamique d’interaction des protéines participant aux LLPS est d’un grand intérêt, car elle est bien résumée par des mesures de leur temps de séjour de liaison (RT), c’est-à-dire le temps qu’elles passent lié dans les condensats. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie de cellules vivantes à molécule unique qui nous permet de mesurer la RT moyenne d’une protéine spécifique dans les condensats. Nous visualisons simultanément les molécules de protéines individuelles et les condensats auxquels elles s’associent, utilisons le suivi des particules uniques (SPT) pour tracer les trajectoires d’une seule molécule, puis ajustons les trajectoires à un modèle de liaison protéine-gouttelette pour extraire la RT moyenne de la protéine. Enfin, nous montrons des résultats représentatifs où cette méthode d’imagerie à molécule unique a été appliquée pour comparer les RT moyens d’une protéine à ses condensats LLPS lorsqu’elle est fusionnée et non fusionnée à un domaine oligomérisant. Ce protocole est largement applicable à la mesure de la dynamique d’interaction de toute protéine qui participe à la LLPS.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

Pleins feux sur l’auteur : Évaluation de la dynamique protéine-condensat dans les cellules humaines vivantes

Mesure à molécule unique de la dynamique d’interaction des protéines dans les condensats biomoléculaires

1 Our lab aims to understand the interaction behaviors<v>2 of intrinsically disordered protein regions 3 and how they play roles in transcriptional regulation 4 in healthy and diseased human cells. 5 In our lab, we develop and use novel 6 single molecule microscopy techniques 7 in combination with molecular biology, 8 biochemical and proteomic approaches 9 to study biomolecular condensates. 10 This protocol enables the quantification of the dynamics 11 by which a specific protein 12 binds to a particular type of condensate 13 in live human cells, 14 and is broadly applicable 15 to measuring the interaction dynamics of any protein 16 that participates in liquid-liquid phase separation.

Nous présentons ici les résultats représentatifs d’Irgen-Gioro et al.40, où nous avons utilisé ce protocole SPT pour comparer la dynamique d’interaction de deux protéines dans leurs condensats LLPS auto-assemblés respectifs. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contient un IDR qui peut subir une LLPS en cas de surexpression dans les cellules humaines. Nous avons émis l’hypothèse que la fusion de TAF15(IDR) à FTH1 (ferritine lourde 1), qui forme un oligomère à 24 ...

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Il a été démontré que de nombreuses protéines intrinsèquement désordonnées participent à la formation de condensats biomoléculaires hautement dynamiques, un comportement important pour de nombreux processus cellulaires. Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie à molécule unique pour quantifier la dynamique par laquelle les protéines interagissent les unes avec les autres dans les condensats biomoléculaires des cellules vivantes.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.5K vues.  California Institute of Technology. 1 Notre laboratoire vise à comprendre les comportementsd’interaction 2 des régions protéiques intrinsèquement désordonnées 3 et comment elles jouent un rôle dans la régulation transcriptionnelle 4 dans les cellules humaines saines et malades. 5 Dans notre laboratoire, nous développons et utilisons de nouvelles 6 techniques de microscopie à molécule unique 7 en combinaison avec la biologie moléculaire, 8 approches biochimiques et protéomiques...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Évaluation de la dynamique protéine-condensat dans les cellules humaines vivantes

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Recherche

Biologie

Halo-Ligand Staining of Cells for Protein Condensate-Interaction Studies Using Single-Molecule Imaging

1 After creating the cell lines<v>2 expressing the HaloTag protein of interest and Halo-H2B, 3 prepare the halo ligand staining reagent 4 separately for both of them. 5 Rinse the cells with two milliliters of PBS. 6 Add halo ligand containing media 7 and incubate them at 37 degrees Celsius 8 with 5%carbon dioxide for one hour.9 After removing the staining media, 10 rinse the cells four times with PBS 11 and incubate them with fresh media devoid of halo ligands. 12 After four such rinse incubation cycles, 13 transfer the cover slip with cells 14 to a microscope stage compatible chamber 15 with sterile forceps. 16 Add phenol red-free media to the chamber before imaging.

Coloration halo-ligand de cellules pour des études d’interaction de condensats de protéines à l’aide de l’imagerie à molécule unique

Single-Molecule Imaging of Halo-Tagged Proteins to Study Protein-Condensate Interactions

1 To begin, obtain ligand stain cells<v>2 expressing halo-tagged protein of interest and halo H2B. 3 After turning on the microscope system, 4 set the live cell incubation parameters 5 and let the system equilibrate. 6 Put a drop of the oil onto 7 a 100x TIRF objective on the microscope 8 and load the cell sample onto the microscope stage.9 To identify a morphologically healthy cell, 10 adjust the Z position 11 and image the cell sample under brightfield illumination. 12 Crop the field of view to capture the target cell nucleus. 13 Using laser illumination, adjust the TIRF angle 14 to achieve hilo illumination with an optimal 15 signal to noise ratio of a single molecule.16 Then, set the exposure time to 500 milliseconds. 17 During the dead time between frames, 18 photo activate the molecules 19 with a 111 microwatt 405 nanometer beam, 20 and during each exposure, excite H2B halo molecules 21 with a 9.1 milliwatt 640 nanometer beam. 22 Initiate image capturing for 2000 frames continuously 23 and gradually increase the power of the 405 nanometer beam 24 upon reduction of photo activated molecules.25 For a halo-tagged protein of interest, 26 split emission wavelengths between two cameras 27 using a long pass dichroic mirror. 28 To the same acquisition parameters demonstrated earlier, 29 add JFX549 channel to acquire one frame every 10 seconds 30 and capture 2000 frames continuously.

Imagerie à molécule unique de protéines marquées à un halo pour étudier les interactions protéine-condensat

Analysis of Single-Molecule Imaging Data to Study Interactions of Halo-Tagged Proteins

1 To begin, perform live cell<v>2 single molecule imaging of HaloTag protein condensates. 3 Using ImageJ, convert each channel 4 from the raw imaging data file 5 into an independent TIFF file. 6 If necessary, run pre-tracking comb.text 7 and follow the prompts 8 to replace any frames with the most recent ones. 9 To load the single molecule of movie file in SlimFast, 10 click on load, followed by image stack. 11 Set the parameters for localization 12 and acquisition under respective option sheets.13 Visualize the localizations of all the molecules. 14 And using lock all, 15 generate a file containing the localizations 16 of all the molecules in every frame. 17 Next, go to load particle data 18 and select SlimFast to load the file 19 with localization and acquisition settings.20 Using option and sheet tracking, 21 adjust the parameters for trajectory generation. 22 Click on gen traj to generate a file 23 containing the trajectories of all the molecules. 24 Load the sheet tracked file into eval SPT 25 and set the parameters 26 to filter out the trajectories shorter than 2.5 seconds.27 Using export data, generate a file 28 with all the filtered trajectories. 29 Running the ImageJ macro, nucleus, 30 and cluster mask version two. text, 31 threshold all the frames of the movie acquired 32 in the JFX549 channel to generate a time lapse movie 33 populated with the time evolving binary mask 34 highlighting condensate locations.35 Using convert ASCII slow tracking CSS 3. M, 36 reformat the trajectories 37 and run categorization version 4. M 38 to sort them based on the lifetime 39 a molecule spends in a condensate.40 Next, using plot residence hist CSS. M, 41 extract the observed dissociation rate 42 of specifically bound molecules 43 and the photobleaching rate from the in condensate 44 protein of interest and the H2B trajectories. 45 Finally, calculate the corrected mean residence time 46 of the protein of interest, 47 specifically bound to its condensates.48 A frame from two-color single molecule movie 49 of TAF15 IDR-Halo-FTH1 shows signals 50 from the nucleus in both PA-JF646 and JFX549 channels. 51 Upon assembling and sorting, 52 a clear distinction was observed for the trajectories 53 of PA-JF646 detected molecules bound to the condensates. 54 The calculated mean residence times 55 after correction for photobleaching 56 were more for TAF15-Halo-FTH1 than Halo-TAF15.