Ce protocole décrit un test colorimétrique à haut débit dans les trois étapes du cycle de vie de Trypanosoma cruzi afin d’identifier de nouveaux candidats médicaments pour la maladie de Chagas. Cela peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides d’une manière facile, rapide et reproductible. Romina Manarin, technicienne en culture cellulaire de laboratoire du laboratoire de Pamela crib, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par cultiver la bêta galactosidase exprimant trypanosoma cruzi epimastigotes dans une fiole de culture tissulaire T-25 et incubez à 28 degrés Celsius pour les cultiver axeniquement. À l’aide d’une chambre de Neubauer, quantifiez la croissance du parasite avant de la sous-cultiver. Pour maintenir les cultures dans une phase logarithmique, sous-cultiver toutes les 48 à 72 heures dans cinq millilitres de milieu LIT complété par 10% FCS et de la geneticine dans le sulfate à une concentration finale de 200 microgrammes par millilitre.
Ensuite, fermez solidement le capuchon avant d’incuber à 28 degrés Celsius en position verticale. À partir de la culture en phase logarithmique, faire une suspension d’épimastigote dans un milieu LIT complété par de la généticine et du sulfate à la concentration finale de 200 000 cellules par millilitre d’épimastigote par millilitre. Après avoir distribué 100 microlitres de suspension par puits d’une plaque de 96 puits, composez le volume final du puits de 200 microlitres avec un milieu.
Fabriquer la suspension de cellules Vero dans du DMEM complété par 2% FCS à la concentration finale de 100 000 cellules par millilitre. Ensemencez 100 microlitres de la suspension par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Incuber les cellules pendant la nuit pour l’adhérence et le lendemain, observez les cellules au microscope.
Le lendemain, rincez trois fois la monocouche de cellules Vero avec 100 microlitres de PBS stérile. Ajouter les trypomastigotes métacycliques précédemment obtenues. Ajouter une multiplicité d’infection ou de MOI de 10-1 dans 100 microlitres de DMEM complété par 2% FCS par puits et incuber pendant six heures comme démontré précédemment.
À la fin de l’incubation, laver la plaque deux fois avec du PBS et ajouter 100 microlitres de DMEM sans rouge phénolique complété par 2% FCS. Après avoir fait la suspension des cellules Vero dans DMEM, ajoutez la concentration finale de 1 million de cellules par millilitre. Ensemencez 800 000 cellules dans cinq millilitres du milieu dans des flacons de T-25 et incubez pendant la nuit pour l’adhérence cellulaire.
Une fois le ballon rincé avec du PBS, ajouter des trypomastigotes, ajouter un MOI de 10-1 dans cinq millilitres de DMEM complété par 2% FCS et incuber pendant la nuit comme démontré précédemment. À la fin de l’incubation, laver la fiole deux fois avec du PBS. Ajouter cinq millilitres de DMEM frais complété par 2% FCS et incuber pendant quatre jours.
À la fin de l’incubation, après avoir observé la présence du surnageant pour les trypomastigotes au microscope optique. Quantifier les trypomastigotes à l’aide d’une chambre de Neubauer. Recueillir le surnageant dans un tube de 15 millilitres et centrifuger à 7 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans du DMEM sans rouge phénolique complété par 2% FCS pour obtenir une concentration de 1 million de trypomastigotes par millilitre. Ensemencez 100 microlitres de la suspension de trypomastigote par puits dans une plaque de 96 puits. Ajouter une solution de benznidazole aux épimastigotes, aux cellules Vero avec des amastigotes ou aux trypomastigotes comme décrit dans le manuscrit du texte.
Ensuite, incubez les épimastigotes, réglez 28 degrés Celsius pendant 72 heures et les trypomastigotes ou cellules Vero infectées avec des amastigotes pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour le test colormétrique, configurez les puits vierges en ajoutant 100 microlitres de PBS ou de milieu correspondant. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de solution de substrat CPRG et 10 microlitres de la solution détergente à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 200 CPRG micromolaires et 0,1% de détergent dans un volume final de 250 microlitres dans chaque puits.
Après l’incubation, à 37 degrés Celsius pendant deux heures, mesurez l’absorbance à 595 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. Dans le logiciel, créez un nouveau protocole en sélectionnant l’absorbance comme méthode de détection et le point de terminaison comme type de lecture, puis cliquez sur OK. Ensuite, ajoutez une étape de lecture.
Tapez la longueur d’onde sélectionnée et cliquez sur OK. Dans la section de mise en page de la plaque, marquez les puits à lire, cliquez sur OK, puis cliquez sur la plaque de lecture, attendez que les valeurs apparaissent à l’écran et exportez-les vers une feuille de calcul pour analyser les résultats et calculer les valeurs d’absorbance à l’aide de la soustraction décrite dans le manuscrit. Dans un logiciel d’analyse statistique, tracez la concentration de BZN par rapport à l’absorbance à 595 nanomètres dans le tableau XY.
Transformez les concentrations de BZN en valeurs logarithmiques en cliquant sur Analyser, en sélectionnant l’option de transformation, puis en cliquant sur OK. Pour obtenir des valeurs IC50, cliquez sur Analyser, puis dans la liste Analyse XY, sélectionnez Ajustement de la courbe de régression non linéaire, puis cliquez sur OK. Ensuite, allez dans la fenêtre des paramètres, dans l’onglet modèle, allez dans le groupe d’inhibition dose-réponse des équations intégrées, sélectionnez inhibiteur de log par rapport à la pente de la variable de réponse pour les paramètres car la méthode dose-réponse laisse tous les autres onglets aux valeurs par défaut, puis cliquez, d’accord.
Cliquez sur la section des résultats pour trouver la valeur IC50, la SD et la qualité de l’ajustement. Cliquez sur la section du graphique pour trouver le graphique XY de la concentration logarithmique du médicament par rapport aux valeurs d’absorbance et assurez-vous que l’ajustement de la courbe est également représenté sous une couleur différente. Dans la présente étude, la valeur de la CI50 obtenue pour les épimastigotes était d’environ 20 micromolaires, similaire aux études précédentes.
En outre, les résultats ont indiqué l’activité de la bêta-galactosidase des épimastigotes au fil du temps. Il est très important d’effectuer au moins des réplications de chaque condition testée et de minimiser les erreurs dans la gestion des volumes.
