L’objectif de ce manuscrit était d’évaluer la pertinence de la quantification simultanée des foyers Gamma H2AX et 53BP1 pour évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes périphériques humains par la bléomycine. Plusieurs facteurs peuvent provoquer des ruptures double brin. Les cellules sont ainsi pourvues de plusieurs mécanismes de réparation, impliquant à la fois Gamma H2AX et 53 Binding Protein 1, qui peuvent co-localiser près de la rupture double brin.
Après avoir prélevé des échantillons de sang total, ajoutez 300 microlitres d’échantillon dans un tube contenant 4,7 millilitres de milieu complet. Ajoutez ensuite cinq microgrammes par millilitre de concentration finale de sulfate de bléomycine. Pour chaque échantillon, mettez en place un contrôle négatif.
Mettez le tube dans un thermostat à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Centrifuger les échantillons à 540 g pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution hypotonique à la pastille.
Ajoutez ensuite 400 microlitres de solution préfixative afin de provoquer une hémolyse. Centrifuger les échantillons à 540 G pendant cinq minutes, puis remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres de méthanol à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour fixer les cellules. Centrifuger les échantillons à 540 G pendant cinq minutes, puis remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres de solution fixatrice.
Répétez cette étape une fois de plus. Centrifuger à nouveau à 540 G pendant cinq minutes, puis aspirer le surnageant en laissant suffisamment de solution pour remettre en suspension la pastille. Déposez la pastille de cellule remise en suspension sur les lames.
Préparer les deux solutions contenant les anticorps primaires anti-Gamma H2AX et anti-53BP1 dissous dans une solution de blocage. Ensuite, lavez les lames deux fois dans PBS 1X. Gardez ensuite les lames pendant 30 minutes dans une solution bloquante.
Ajouter à chaque lame 10 microlitres de chacune des deux solutions contenant les anticorps primaires dissous dans la solution bloquante. Couvrez les diapositives avec du parafilm. Incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Après l’incubation, effectuez trois lavages dans PBS 1X pendant cinq minutes. Préparez les deux solutions contenant les anticorps secondaires DyLight 488 et Alexa Fluor 568 dissous dans une solution bloquante. Ajouter ensuite à chaque lame 10 microlitres de chacune des deux solutions contenant les anticorps secondaires dissous dans la solution de blocage.
Couvrir les lames de parafilm et incuber à température ambiante pendant deux heures. Après cette deuxième incubation, effectuez trois lavages dans PBS 1X pendant cinq minutes. Ajouter 2,5 microlitres de solution antidécoloration avec DAPI sur les bordereaux de couvercle avant l’assemblage pour contrer la tache des noyaux.
Afin d’évaluer la cinétique des foyers, la procédure est la même que celle décrite ci-dessus. La dernière phase est l’observation et la quantification des foyers. Les lymphocytes humains sans foyers Gamma H2AX et 53BP1 sont représentés dans A, dans B, et dans C, les lymphocytes humains avec différentes quantités de foyers Gamma H2AX et 53BP1 sont montrés.
On observe un faible niveau de co-localisation des foyers. Comme prévu, une fréquence très élevée des foyers Gamma H2AX et 53BP1 est observée entre les cellules non traitées non traitées. En outre, une grande différence est observée dans le nombre de foyers des deux marqueurs.
L’évolution temporelle des foyers Gamma H2AX et 53BP1 au fil du temps a montré un comportement différent bien qu’ils contribuent à la même fonction. L’analyse des foyers gamma H2AX et 53BP1 a la capacité d’évaluer la réponse cellulaire dans des contextes d’exposition ou pathologiques. Cependant, la double immunofluorescence Gamma H2AX et 53BP1 peut conduire à sous-estimer la fréquence réelle de l’événement.
