NIH K08 EB003996

1. Poly-L-lactique (PLLA) filage en solution <ol><li> Dissoudre 0,4 g PLLA dans 9 ml de chloroforme en agitant à feu doux. </li><li> Ajouter 1 ml de diméthylformamide à la solution, amenant la concentration finale de la solution à 4% PLLA (p / v) dans le chloroforme: DMF 9:1 (v / v). </li><li> Placer la solution dans un polypropylène ou d&#39;une seringue en verre avec une pointe en métal 23ga émoussé. </li></ol> 2. Filature 1 Préparation du support <ol><li> Faire une solution à 8% (p / v) de 85:15 PLGA (poly-lactique-co-acide glycolique) dans le chloroforme en agitant à feu doux. </li><li> Manteau glisse propre couvercle de verre dans PLGA en recouvrant la surface de chaque lamelle avec la solution de PLGA. Laisser sécher le PLGA d&#39;un film mince (env. 30 min). </li></ol> 3. Électrofilage 2 <ol><li> Fixez PLGA couvercle verre enduit glisse vers le collecteur avec du ruban de carbone conducteur. Pour les fibres alignées, le collecteur est une roue motorisée. Pour les fibres au hasard, le collecteur est un plateau fixe. </li><li> Placer dans une seringue à embout de la pompe de 20 cm de la roue de collecteur. Régler la pompe à environ 2 ml / h et si vous utilisez une roue, régler le moteur à 300-400 RPM. Si possible, appliquer un malus de -2 kV DC biais vers le collecteur et le 15 kV à pointe métallique. En l&#39;absence d&#39;accès à une alimentation bipolaire, terrain du collecteur. </li><li> Fibres va jet du bout de la seringue et recueillir sur la roue en rotation. Continuez jusqu&#39;à ce que la filature de fibres de densité désirée est obtenue. Glissez la pointe en métal avec une serviette en papier fixée à une tige non conductrice périodiquement pour éviter le colmatage à la pointe. </li></ol> 4. Moating 1 <ol><li> Suite à filer, «fossé» les échantillons électrofilé par pipetage une ligne de PLGA autour du périmètre de la lamelle. Autoriser le PLGA à sécher. Ce sera de maintenir l&#39;alignement des fibres au cours de la culture. </li></ol> 5. Revêtement des protéines <ol><li> Fibres de verre et de contrôles électrofilées besoin d&#39;être recouvert de protéines avant la culture cellulaire. Couvrir les substrats dans une solution de protéines pour moins d&#39;une heure et puis aspirer l&#39;excès de solution et continuer jusqu&#39;à ce que l&#39;aspiration des substrats sont secs. Solutions de protéines possibles comprennent: PLL (poly-L-lysine) (100 pg / ml), la laminine (25 ug / ml) ou de la fibronectine (50 ug / ml). Si PLL est utilisée, les supports doivent être rincés à l&#39;eau stérile et séché deux fois par la suite le revêtement initial. </li></ol> 6. Obtenir E15 embryons de rat 3 * Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec le Guide du NIH pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire approuvé par l&#39;Université du Michigan Comité sur l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux. <ol><li> Préparation: Vérifiez si l&#39;animal est enceinte. Dégel 3 ml de trypsine, 3 ml de FBS et chaleureuse d&#39;une bouteille de L15. Incendie polir une pipette Pasteur. Désinfecter tous les instruments chirurgicaux dans l&#39;éthanol 70% pendant 30 min. </li><li> Préparer et chaleureux des médias placage (voir tableau 1). </li><li> Euthanasie: Effectuer une injection IP de kétamine / xylazine. Attendez 10-15 minutes et vérifiez l&#39;absence de la cornée et la pédale réflexes de retrait. Une fois que les réflexes sont absents, exécuter une injection IC de pentobarbital (FatalPlus). </li><li> Tente de la peau de l&#39;abdomen. Couper à travers la peau et les couches musculaires pour exposer la cavité abdominale. Localisez l&#39;utérus et le détacher au niveau du col et des ovaires. </li><li> Retirez les embryons dans l&#39;utérus avec des ciseaux et de les placer immédiatement dans L15 chaud. (Toutes les procédures suivantes sont accomplies sous un microscope à dissection et d&#39;embryons et les cordons disséqués doit être immergé dans L15 chaude à tout moment.) Décapitez les embryons par la fermeture des pinces autour du menton et en dessous de l&#39;os occipital du crâne. </li></ol> 7. Dissection 3 <ol><li> Placez l&#39;embryon d&#39;un côté. Protéger la moelle épinière avec un jeu de pinces tout en utilisant l&#39;autre ensemble de dépouiller membres et des organes abdominaux. </li><li> Tournez l&#39;embryon et le tient stable avec un jeu de pinces. Snip le long de la longueur de l&#39;embryon, à partir du cou à la queue, jusqu&#39;à ce que le cordon entier est exposé. </li><li> Saisir l&#39;extrémité de la corde et tirez soigneusement sur lui-même vers la queue à enlever. Le cordon va tirer gratuitement à membrane et les ganglions de la racine dorsale (DRG) ci-joint. </li><li> Si DRG explant ou dissocié de la culture neurone sensoriel doit être exécuté, snip la DRG hors du cordon et les transférer sur un plat frais de L15 chaud. <ol><li> Pour la culture DRG explant, passez à l&#39;étape 10.2 </li><li> Pour la culture des neurones sensoriels dissocié, passez à l&#39;étape 9 </li><li> Pour des neurones moteurs de la culture, la DRG sera supprimée avec la membrane à l&#39;étape 7.5 </li></ol></li><li> Retirer la membrane de la moelle épinière en la saisissant à l&#39;extrémité supérieure du cordon et le peler bas, similaire à enlever une chaussette longue. Répétez l&#39;opération pour tous les embryons puis hachez les cordes en petits (2-3 mm) pièces. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 8. Motoneurone (MN) Traitement 5,6,7 <ol><li> Verser les cordes coupées et L15 dans une conique et tourne à 1000 RPM pendant 2-3 min pour culotter les morceaux. </li><li> Décanter le surnageant et ajouter 3 ml de trypsine pour les cordes en granulés. Incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 20 min. </li><li> Ajouter 3 ml de FBS à conique et tournent à 1000 RPM pendant 2-3 min à nouveau à granulés. </li><li> Décanter le surnageant et le manteau d&#39;un incendie polie pipette Pasteur avec du FBS. </li><li> Ajoutez une pipette Pasteur plein de L15 à la forme conique et ensuite triturer doucement jusqu&#39;à ce que la solution est homogène, sans grumeaux visibles. Eviter les bulles. </li><li> Préparer une solution de 9% des Optiprep au L15. Préparer un tube avec 3 mL de la solution Optiprep pour deux embryons (s&#39;il ya un nombre impair d&#39;embryons, arrondir). </li><li> Déposer la solution homogénéisée sur la solution Optiprep, en le divisant équitablement entre tous les tubes. Faites tourner les tubes à 2000 RPM pendant 15 min. </li><li> Recueillir soigneusement les premiers 2 ml de chaque tube et d&#39;une piscine dans un cône de 50 mL. Remplissez le conique avec L15 et tournent à 1000 RPM pendant 5 min pour se rincer les cellules de Optiprep. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une petite quantité de médias plaquage (250-500 pi). Compter les cellules en utilisant exclusion du bleu trypan pour identifier les cellules vivantes. Passer à l&#39;étape 10.1 </li></ol> 9. Sensory Neuron (SN) Transformation 7 <ol><li> Verser le DRG retiré de la moelle épinière et L15 dans un tube conique et tourne à 1000 RPM pendant 2-3 min pour culotter les morceaux. </li><li> Décanter le surnageant et ajouter 3 ml de trypsine pour la DRG granulés. Incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Ajouter 3 ml de FBS à conique et tournent à 1000 RPM pendant 2-3 min à nouveau à granulés. </li><li> Décanter le surnageant et le manteau d&#39;un incendie polie pipette Pasteur avec du FBS. </li><li> Ajoutez une pipette Pasteur plein de L15 à la forme conique et ensuite triturer doucement jusqu&#39;à ce que la solution est homogène, sans grumeaux visibles. Eviter les bulles. </li><li> Spin l&#39;homogénat à 1000 RPM pendant 5 min. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une petite quantité de médias plaquage SN (250-500 pi). Compter les cellules en utilisant exclusion du bleu trypan pour identifier les cellules vivantes. Passez à l&#39;étape 10.1 </li></ol> 10. Placage et Culture <ol><li> Pour dissocier SN ou MN culture: <ol><li> Couvrir les substrats avec quelques gouttes de médias, puis ajouter un volume approprié de cellules en suspension. Les cellules dissociées doivent être étalées à une faible densité (25-50 cellules / mm 2). Laisser les cellules adhérer pendant au moins une heure avant l&#39;inondation du puits avec les médias. </li></ol></li><li> Pour la culture des explants DRG: <ol><li> Couvrir les substrats avec quelques gouttes de médias puis ajouter DRG aux médias. Disposez les DRG de sorte qu&#39;ils sont répartis à travers le substrat (environ 4 GHM tient sur une lamelle mm 22x22). Laisser le DRG adhérer pendant au moins 4 heures avant l&#39;inondation du puits avec les médias. </li></ol></li><li> Les cultures peuvent être maintenues jusqu&#39;à 4 jours sans changer de support. Pour plus des cultures, la moitié des modifications des médias doit être fait avec les médias nourrissent. Flux des médias est la même composition que les médias plaquage moins la L-glutamine. </li></ol> 11. Immunocytochimie 1,5,8 <ol><li> Fixation des cellules: les médias et la remplacer par Aspirer chaude 4% PFA (paraformaldéhyde) pendant 30 min. Effectuez ensuite 3X 5 min 1x lave PBS. </li><li> Blocage / perméabilisation: Préparer bloc / perm solution (1,25% de sérum albumine bovine dans du PBS 1X, 0,05% Triton X-100 et de 2,0% de sérum de chèvre normal). Aspirer PBS et appliquer bloc / perm solution pour échantillons pendant 30 minutes. Effectuez ensuite 1X 5 min 1x lave PBS. </li><li> L&#39;anticorps primaire: Préparer la solution d&#39;anticorps primaire de travail (10% de sérum de chèvre normal, 1,25% d&#39;albumine sérique bovine, 0,1% de Na azide, 0,05% de Triton X-100 et à 10 mL avec du PBS 1X). Ajouter la quantité appropriée d&#39;anticorps primaire (voir tableau 2). Ligne plusieurs plats avec du parafilm. Placer un cordon de 200 ul de solution d&#39;anticorps primaire sur la parafilm pour chaque substrat. Inverser les substrats, flottant entre eux cellule vers le bas côté de la solution d&#39;anticorps primaire travaille la nuit (si la salle est climatisée ou particulièrement sec, un morceau de papier saturé d&#39;eau peut être ajoutée à un coin du plat pour éviter l&#39;évaporation de la solution de travail) . </li><li> L&#39;anticorps secondaire: Enlever les substrats de la primaire (la solution de travail peuvent être collectées, stockées à 4 ° C et réutilisés) et d&#39;effectuer 2x 5 min 1x lave PBS. Appliquer 200 ul d&#39;anticorps secondaires dilué 1:200 dans du PBS (également inversé sur parafilm plat bordé) pendant 4 heures. </li><li> Retirer du secondaire, puis effectuer 2x 5 min 1x lave PBS. Substrats mont sur des lames d&#39;or avec Prolongez contenant DAPI ou un autre compteur convient colorant nucléaire. </li></ol> 12. Les résultats représentatifs: La morphologie typique d&#39;alignement et de hasard elfibres ectrospun sont présentés dans la figure 1. Nous généralement obtenir une pureté de MN&gt; 90% des neurones 7,8 avec ce protocole et nous avons maintenu DRG cultures aussi longtemps que une semaine sans aucune croissance des fibroblastes significative. La figure 2 montre l&#39;aspect typique de MN sur les fibres de verre et après 24 heures de culture et d&#39;immunomarquage. DRG immunocolorés culture pendant trois jours sur le verre et les fibres sont illustrés dans la Figure 3. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Figure 1" /> L&#39;alignement des fibres Figure 1. Est manipulé par le choix du collectionneur. A.) alignés fibres filées sur un collecteur de roue tournante et B.) fibres aléatoire filé sur un collecteur de plaque stationnaire. Barres d&#39;échelle = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Neurones moteurs Représentant colorées pour TuJ1 (vert) et le DAPI (bleu) après 24 heures de culture sur A. revêtement PLL) fibres et B.) en verre. Barres d&#39;échelle = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Teinté DRG Représentant pour neurofilaments (vert) après 3 jours de culture sur PLL revêtement A.) en verre et B.) des fibres. Barres d&#39;échelle = 200 pm. <table border="1"><tbody><tr><td> Solution mère: </td><td> MN médias: </td><td> DRG / SN médias: </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 d&#39;albumine </td><td> 12,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 apo-transferrine </td><td> 50 ul </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> 50 pg ml -1 β-estradiol </td><td> 2,7 ul </td><td> 2,2 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mg mL -1 biotine </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 catalase </td><td> 8 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 mg mL -1 D-galactose </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 d&#39;hydrocortisone </td><td> 3,7 ul </td><td> 2,9 ul </td></tr><tr><td> 0,63 mg mL -1 progestérone </td><td> 0,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 putrescine </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 pg ml -1 sélénium </td><td> 3,4 ul </td><td> 4,1 ul </td></tr><tr><td> 2,5 mg ml -1 superoxyde dismutase </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ng mL -1 facteur de croissance nerveuse </td><td> - </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 ml </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> * 2 mM L-glutamine </td><td> 35 pl </td><td> 35 pl </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> à 50 mL </td><td> à 50 mL </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Ajouter astérisque (*) des composants aux médias juste avant l&#39;utilisation. Les autres composants peuvent être préparées comme une solution de réserve et conservés à -20 ° C jusqu&#39;au moment de servir 6,7. <table border="1"><tbody><tr><td> Primaire (concentration) </td><td> Neurones: </td><td> Glia: </td><td> Fibroblastes: </td></tr><tr><td> anti-β-tubuline (TuJ1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-neurofilaments (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-S-100 (1:250) </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> anti-p75 NGFR (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> Tableau 2. La sélection d&#39;anticorps primaire dépend des objectifs de l&#39;enquêteur. Le ci-dessus sont plusieurs anticorps et les concentrations, nous avons utilisé avec succès dans notre laboratoire. S-100 est particulièrement utile pour identifier les cellules de Schwann et / ou vérifier les contaminer les fibroblastes, mais notez qu&#39;il doit être utilisé en combinaison avec NGFR p75 de distinguer entre les cellules gliales et de fibroblasts4. Nous avons également remarqué que NGFR p75 taches neurites très légèrement tout en neurofilaments ou TuJ1 sont d&#39;excellents choix si le but est de visualiser neurites individuels.

<ol>
	<li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons.">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li><li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications.">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland.">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li><li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth.">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li><li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death.">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li><li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal.">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li><li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers.">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li><li>Tan, S. -. H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process.">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li><li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications.">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li></ol>

Ce protocole comporte plusieurs étapes cruciales. Le premier concerne la production proprement dite des substrats de fibres électrofilé. Dans les milieux liquides, les fibres PLLA, PLGA films et les douves PLGA sera séparée de la lamelle de verre comme une seule unité. Si le PLGA est omis, les fibres PLLA ne restera pas une feuille plate - ils se recroquevillent dans un enchevêtrement inutilisable. Ainsi, le film de PLGA est inclus comme un substrat adéquat pour maintenir l&#39;alignement des fibres pendant la culture. Le fossé est ajouté après le filage à la fois pour s&#39;assurer que les fibres sont solidement fixées au film PLGA et d&#39;ajouter à la rigidité structurelle du film. Le fossé est aussi une poignée utile lorsque les substrats sont manipulés lors de la fixation, la coloration et de montage. La trituration est la deuxième étape critique. Tous les efforts doivent être faits pour éviter la formation de bulles. De plus, nous avons obtenu des rendements beaucoup plus élevés quand une pipette polie au feu est utilisé pour cette étape. Pour le feu polonais, allumer un bec Bunsen et joindre une ampoule à la pipette. Passez l&#39;extrémité de la pipette rapidement à travers la flamme 2-3 fois tout en continuant à presser et relâcher l&#39;ampoule - le débit d&#39;air grâce à la pipette aidera à prévenir la pointe de se refermer complètement. Examiner la pointe de la pipette pour s&#39;assurer que le trou est toujours ouverte et que les bords apparaissent légèrement arrondi avant l&#39;utilisation. Électrofilage est un processus très polyvalent; les paramètres électrofilage peuvent être modifiés pour produire des fibres avec une variété de morphologies. Tan et al. (2005) détaille une étude systématique des paramètres affectant le diamètre des fibres électrofilées PLLA. Wang et al. (2009) présente une étude détaillée des paramètres influençant l&#39;alignement des fibres PLLA électrofilé.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PLLA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boehringer Ingelheim</td>
<td>Resomer L210</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PLGA 85:15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>43471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>A2289 
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Apo-transferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Akron </td>
<td>AK8227</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>AC 23009-0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>G0625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7556</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Selenium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>S9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-estradiol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>E 1132 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>H0396</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>C40 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superoxide dismutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>S4636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PSN</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15640 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene </td>
<td>1680149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene </td>
<td>1689149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>26140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optiprep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate </td>
<td>2011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PLL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P4832 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>F 4759 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7906</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-TuJ1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556321</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-neurofilament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>AB1987</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-S100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-NGFR p75</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N3908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal goat serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G6767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>13073-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Prolong Gold +DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36931</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-l-lactide nanofiber scaffolds

Électrofilage est une technique pour produire des micro-nano-échelle des fibres. Les fibres peuvent être électrofilé avec divers degrés de l&#39;alignement, de très alignés complètement aléatoire. En outre, les fibres peuvent être tissés à partir de divers matériaux, y compris les polymères biodégradables tels que la poly-L-lactique (PLLA). Ces caractéristiques font de fibres électrofilées approprié pour une variété d&#39;applications d&#39;échafaudages en ingénierie tissulaire. Notre accent est mis sur l&#39;utilisation de fibres électrofilé alignés pour la régénération des nerfs. Nous avons précédemment montré que les fibres alignées électrofilé PLLA directe l&#39;excroissance des deux neurones sensoriels et moteurs primaires in vitro. Nous soutenons que l&#39;utilisation d&#39;un système de culture de cellules primaires est essentielle lors de l&#39;évaluation des biomatériaux pour les neurones véritable modèle in vivo trouve aussi près que possible. Ici, nous décrivons les techniques utilisées dans notre laboratoire pour electrospin échafaudages fibreux et la culture des explants ganglions de la racine dorsale, ainsi que dissocié neurones sensoriels et moteurs, sur des échafaudages électrofilé. Toutefois, l&#39;électrofilage et / ou des techniques de culture présentées ici sont facilement adaptés pour une utilisation dans d&#39;autres applications.

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The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Alignés fibres électrofilées diriger la croissance des neurones in vitro et sont un élément potentiel de régénération nerveuse échafaudages. Nous décrivons une procédure pour la préparation des substrats de fibres électrofilé et la culture sans sérum de rat E15 sensorielles primaires (DRG) et les neurones moteurs. Visualisation des neurones par immunocytochimie est également inclus.

La culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-L-lactide nanofibres

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K vues.  University of Michigan. Alignés fibres électrofilées diriger la croissance des neurones in vitro et sont un élément potentiel de régénération nerveuse échafaudages. Nous décrivons une procédure pour la préparation des substrats de fibres électrofilé et la culture sans sérum de rat E15 sensorielles primaires (DRG) et les neurones moteurs. Visualisation des neurones par immunocytochimie est également inclus.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...