NIH K08 EB003996

1. Poly-L-Milchsäure (PLLA) Spinning-Lösung <ol><li> Lösen Sie 0,4 g PLLA in 9 mL Chloroform unter Rühren bei schwacher Hitze. </li><li> 1 ml Dimethylformamid auf die Lösung, womit sich die Endkonzentration der Lösung auf 4% PLLA (w / v) in Chloroform: DMF 9:1 (v / v). </li><li> Legen Sie die Lösung in einem Polypropylen oder Glas-Spritze mit einer stumpfen 23ga Metallspitze. </li></ol> 2. Spinning Substrat Vorbereitung 1 <ol><li> Machen Sie einen 8% (w / v) Lösung von 85:15 PLGA (Poly-Milchsäure-co-Glycolsäure) in Chloroform unter Rühren bei schwacher Hitze. </li><li> Coat sauber Glasdeckgläschen in PLGA durch Abdecken der Oberfläche jedes Deckglas mit der PLGA-Lösung. Lassen Sie die PLGA zu einem dünnen Film (ca. 30 min) trocknen lassen. </li></ol> 3. Elektrospinnen 2 <ol><li> Sichere PLGA beschichtet Glasdeckgläschen zum Kollektor mit leitfähigem Kohlenstoff Band. Für ausgerichteten Fasern, ist der Kollektor einer motorisch angetriebenen Rades. Für Wirrfasern, ist der Kollektor eine stationäre Platte. </li><li> Legen Spritze in Pumpe mit Spitze 20 cm vom Kollektor Rad. Set Pumpe auf ca. 2 ml / h und bei Verwendung eines Rades, die den Motor auf 300-400 RPM. Wenn möglich, tragen Sie eine -2 kV DC-Vorspannung an den Kollektor und +15 kV auf Metallspitze. In Abwesenheit des Zugangs zu einer bipolaren Spannungsversorgung, Masse des Kollektors. </li><li> Fasern Strahl aus der Spritze und sammeln auf dem rotierenden Rad. Weiter dreht, bis die gewünschte Dichte der Fasern erreicht wird. Swipe der Metall-Spitze mit einem Papiertuch angebracht, um eine nicht-leitenden Stab in regelmäßigen Abständen zur Vermeidung von Verstopfungen an der Spitze. </li></ol> 4. Moating 1 <ol><li> Nach Spinnen, &quot;Graben&quot; der elektrogesponnenen Proben durch Pipettieren einer Reihe von PLGA um den Umfang des Deckglases. Lassen Sie die PLGA, um zu trocknen. Dies erhält die Ausrichtung der Fasern während der Kultur. </li></ol> 5. Protein-Beschichtung <ol><li> Elektrogesponnene Fasern und Glas Kontrollen müssen in Protein vor Zellkultur beschichtet werden. Decken Sie die Substrate in einem Protein-Lösung für mindestens eine Stunde und dann absaugen überschüssige Lösung und weiterhin Absaugen, bis die Substrate trocken sind. Mögliche Protein-Lösungen gehören: PLL (Poly-L-Lysin) (100 pg / mL), Laminin (25 ug / mL) oder Fibronektin (50 ug / mL). Wenn PLL verwendet wird, sollte Substrate in sterilem Wasser gespült und getrocknet werden zweimal nach der ersten Beschichtung. </li></ol> 6. Erhalten E15 Rattenembryonen 3 * Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den NIH Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren durch die University of Michigan Ausschuss für Verwendung und Pflege von Tieren zugelassen getan. <ol><li> Zubereitung: Prüfen Sie, ob das Tier schwanger ist. Thaw 3 ml Trypsin, 3 ml FBS und warm eine Flasche L15. Feuer Politur einer Pasteurpipette. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente in 70% Ethanol für 30 min. </li><li> Vorbereiten und warmen plating Medien (siehe Tabelle 1). </li><li> Euthanasie: Führen Sie eine IP-Injektion von Ketamin / Xylazin. Warten Sie 10-15 Minuten und überprüfen Sie die fehlenden Hornhaut-und Pedal-Rücktritt Reflexe. Sobald Reflexe fehlen, führen Sie eine IC Injektion von Pentobarbital (FatalPlus). </li><li> Tent die Haut des Bauches. Schnitt durch die Haut-und Muskelschichten der Bauchhöhle aussetzen. Suchen Sie die Gebärmutter und lösen sie auf den Gebärmutterhals und Eierstöcken. </li><li> Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Schere und legen Sie sie sofort in warmes L15. (Alle folgenden Verfahren werden unter einem Binokular und Embryonen abgeschlossen und seziert Kabel sollten in warmen L15 jederzeit getaucht werden.) Enthaupten die Embryonen durch die Schließung einer Pinzette um das Kinn und unter dem Hinterhauptbein des Schädels. </li></ol> 7. Dissection 3 <ol><li> Setzen Sie den Embryo auf einer Seite. Schützen Sie das Rückenmark mit einem Satz von Zangen, während Sie den anderen Satz zu abstreifen Gliedmaßen und Bauchorgane. </li><li> Drehen Sie den Embryo und hält es fest mit einem Satz von Zangen. Snip entlang der Länge des Embryos, aus dem Hals bis zum Schwanz, bis das gesamte Kabel ausgesetzt ist. </li><li> Fassen Sie das Ende des Kabels vorsichtig und ziehen ihn über sich selbst auf den Schwanz zu entfernen. Die Schnur ziehen wird kostenlos mit Membran und Spinalganglien (DRG) befestigt. </li><li> Wenn DRG Explantation oder dissoziierte sensorischen Neuronen Kultur durchgeführt werden soll, snip der DRG ohne Kabel und deren Verlegung an einen frischen Teller warme L15. <ol><li> Für DRG Explantation Kultur, überspringen auf 10,2 Schritt </li><li> Für dissoziiert sensorischen Neuronen Kultur, fahren Sie mit Schritt 9 </li><li> Für Motoneuronen Kultur, wird der DRG mit der Membran in Schritt 7,5 entfernt werden </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Membran aus dem Rückenmark, indem Sie es am oberen Ende der Schnur und Peeling it down, ähnlich wie das Entfernen einer langen Socke. Wiederholen Sie dies für alle Embryonen und dann hacken Sie die Kabel in kleine (2-3 mm) Stück. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 8. Motor Neuron (MN) Verarbeitung 5,6,7 <ol><li> Gießen Sie die gehackte Schnüre und L15 in eine konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min zur Pelletierung der Stücke. </li><li> Abgießen des Überstandes und 3 ml Trypsin auf die pelletierten Schnüre. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 20 min. </li><li> Add 3 mL FBS, konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min wieder Pellet. </li><li> Abgießen des Überstandes und Mantel ein Feuer poliert Pasteurpipette mit FBS. </li><li> Fügen Sie eine Pasteurpipette voll von L15 die konische und dann sanft verreiben, bis die Lösung homogen ist ohne sichtbare Klumpen. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Bereiten Sie einen 9% igen Optiprep in L15. Bereiten Sie ein Rohr mit 3 mL der Optiprep Lösung für alle zwei Embryonen (wenn es eine ungerade Anzahl von Embryonen, bis Runde). </li><li> Löschen Sie die homogenisierte Lösung auf die Optiprep Lösung, teilt sie gleichmäßig unter allen Rohren. Drehen Sie das Röhrchen bei 2000 RPM für 15 min. </li><li> Sorgfältig sammeln die Besten 2 mL von jeder Röhre und Pool in einem 50 ml konischen. Füllen Sie den konisch mit L15 und Spin bei 1000 RPM für 5 min auf die Zellen des Optiprep spülen. </li><li> Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge von plating Medien (250-500 ul). Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf lebende Zellen zu identifizieren. Direkt auf 10,1 Schritt </li></ol> 9. Sensory Neuron (SN) Ihnen 7 <ol><li> Gießen Sie die DRG aus dem Rückenmark und L15 in einem konischen Rohr und Spin entfernt bei 1000 RPM für 2-3 min zur Pelletierung der Stücke. </li><li> Abgießen des Überstandes und 3 ml Trypsin auf die pelletierten DRG. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10 min. </li><li> Add 3 mL FBS, konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min wieder Pellet. </li><li> Abgießen des Überstandes und Mantel ein Feuer poliert Pasteurpipette mit FBS. </li><li> Fügen Sie eine Pasteurpipette voll von L15 die konische und dann sanft verreiben, bis die Lösung homogen ist ohne sichtbare Klumpen. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Drehen Sie das Homogenat bei 1000 rpm für 5 min. Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge von SN Beschichtung Medien (250-500 ul). Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf lebende Zellen zu identifizieren. Weiter auf 10,1 Schritt </li></ol> 10. Plating und Kultur <ol><li> Für dissoziiert SN oder MN Kultur: <ol><li> Decken Sie die Substrate, die mit ein paar Tropfen Medien fügen Sie dann ein geeignetes Volumen der Zellsuspension. Dissoziierten Zellen sollte bei einer geringen Dichte (25-50 Zellen / mm 2) beschichtet werden. Lassen Sie die Zellen für mindestens eine Stunde vor Überschwemmungen die Brunnen mit den Medien zu halten. </li></ol></li><li> Für DRG Explantation Kultur: <ol><li> Decken Sie die Substrate, die mit ein paar Tropfen Medien fügen Sie dann an die Medien DRG. Ordnen Sie die DRG, so dass sie gleichmäßig auf dem Substrat (ca. 4 DRG wird auf einem 22x22 mm Deckglas fit) verteilt werden. Lassen Sie die DRG für mindestens 4 Stunden vor Überschwemmungen die Brunnen mit den Medien zu halten. </li></ol></li><li> Kulturen können beibehalten werden bis zu 4 Tage ohne Medienbruch zu ändern. Für längere Kulturen, sollte die Hälfte Medien ändert sich mit feed Medien durchgeführt werden. Feed Medien ist die gleiche Zusammensetzung wie plating Medien abzüglich der L-Glutamin. </li></ol> 11. Immunocytochemistry 1,5,8 <ol><li> Fixierung von Zellen: Absaugen Medien und ersetzen mit warmem 4% PFA (Paraformaldehyd) für 30 min. Führen Sie dann 3x 5 min 1x PBS gewaschen. </li><li> Blocking / Permeabilisierung: Bereiten block / perm Lösung (1,25% Rinderserumalbumin in 1X PBS, 0,05% Triton X-100 und 2,0% normalem Ziegenserum). Absaugen PBS und gelten block / perm Lösung, um Proben für 30 Minuten. Führen Sie dann 1x 5 min 1x PBS gewaschen. </li><li> Primärer Antikörper: Bereiten primärer Antikörper-Arbeitslösung (10% normales Ziegenserum, 1,25% Rinderserumalbumin, 0,1% Na-Azid, 0,05% Triton X-100 und zu 10 ml mit 1x PBS). Fügen Sie die entsprechende Menge des primären Antikörpers (siehe Tabelle 2). Linie verschiedene Gerichte mit Parafilm. Legen Sie eine 200 ul Perle der primären Antikörper-Lösung auf dem Parafilm für jeden Untergrund. Kehren Sie die Substrate, schwimmende ihnen Zelle nach unten auf dem primären Antikörper funktionierende Lösung über Nacht (wenn der Raum ist klimatisiert oder besonders trocken ist, kann ein Stück Wasser gesättigt Papier in eine Ecke der Schale hinzugefügt werden, um Verdunstung des funktionierende Lösung zu verhindern) . </li><li> Sekundäre Antikörper: Entfernen Sie die Substrate aus dem primären (die funktionierende Lösung können gesammelt werden, bei 4 ° C und wiederverwendet werden) und führen 2x 5 min 1x PBS gewaschen. Apply 200 ul sekundären Antikörper verdünnt 1:200 in PBS (auch auf Parafilm gesäumt Gericht invertiert) für 4 Stunden. </li><li> Entfernen Sie aus sekundären führen Sie dann 2x 5 min 1x PBS gewaschen. Berg Substrate auf Objektträgern mit Prolong goldhaltigen DAPI oder einem anderen geeigneten nuklearen Gegenfärbung. </li></ol> 12. Repräsentative Ergebnisse: Die typische Morphologie ausgerichtet und zufällige electrospun Fasern sind in Abbildung 1 dargestellt. Wir in der Regel erhalten MN Reinheit von&gt; 90% Neuronen 7,8 mit diesem Protokoll und wir haben gewartet DRG Kulturen so lange wie 1 Woche ohne nennenswerte Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Abbildung 2 zeigt typische MN Auftritt auf Glas und Fasern nach 24 Stunden Kultur-und Immunfärbung. Immungefärbte DRG für drei Tage auf Glas und Fasern kultiviert werden in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Fiber Alignment wird durch die Wahl des Kollektors manipuliert. A.) Fasern auf einem rotierenden Rad Sammler und B. gesponnen Aligned) random Fasern versponnen auf eine stationäre Platte Sammler. Maßstabsbalken = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Representative Motoneuronen für TuJ1 (grün) und DAPI (blau) nach 24 Stunden der Kultur auf PLL beschichteten A. gebeizt) Fasern und B.) Glas. Maßstabsbalken = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Representative DRG gefärbt Neurofilament (grün) nach 3 Tagen Kultur auf PLL beschichteten A.) Glas und B.) Fasern. Maßstabsbalken = 200 um. <table border="1"><tbody><tr><td> Stammlösung: </td><td> MN Medien: </td><td> DRG / SN Medien: </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 Albumin </td><td> 12,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 apo-Transferrin </td><td> 50 pl </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> 50 ug mL -1 β-Estradiol </td><td> 2,7 ul </td><td> 2,2 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mg mL -1 Biotin </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 Katalase </td><td> 8 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 mg mL -1 D-Galaktose </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 ug mL -1 Hydrocortison </td><td> 3,7 ul </td><td> 2,9 ul </td></tr><tr><td> 0,63 mg mL -1 Progesteron </td><td> 0,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 Putrescin </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 ug mL -1 Selen </td><td> 3,4 ul </td><td> 4,1 ul </td></tr><tr><td> 2,5 mg mL -1 Superoxiddismutase </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ng mL -1 nerve growth factor </td><td> - </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 mL </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 2 mM L-Glutamin </td><td> 35 ul </td><td> 35 ul </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> auf 50 mL </td><td> auf 50 mL </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Hinzufügen Stern (*)-Komponenten zu den Medien kurz vor dem Gebrauch. Die restlichen Komponenten kann als Stammlösung hergestellt werden und bei -20 ° C bis zum Gebrauch 6,7. <table border="1"><tbody><tr><td> Primary (Konzentration) </td><td> Neurons: </td><td> Glia: </td><td> Fibroblasten: </td></tr><tr><td> anti-β-Tubulin (TuJ1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> Anti-Neurofilament (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> Anti-S-100 (1:250) </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> Anti-NGFR p75 (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Die Auswahl des primären Antikörpers ist abhängig von den Zielen der Ermittler. Die oben genannten sind mehrere Antikörper und die Konzentrationen wir mit Erfolg in unserem Labor verwendet wurden. S-100 ist besonders nützlich, um Schwann-Zellen zu identifizieren und / oder schau auf kontaminierende Fibroblasten, aber beachten Sie, dass es in Kombination muss mit NGFR p75 verwendet werden, um zwischen Gliazellen und fibroblasts4 unterscheiden. Wir haben auch bemerkt, dass NGFR p75 Flecken sehr leicht Neuriten während Neurofilament oder TuJ1 ausgezeichnete Wahl sind, wenn das Ziel ist es, individuelle Neuriten zu visualisieren.

<ol>
	<li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons.">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li><li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications.">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland.">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li><li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth.">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li><li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death.">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li><li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal.">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li><li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers.">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li><li>Tan, S. -. H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process.">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li><li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications.">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li></ol>

Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Die erste umfasst die ordnungsgemäße Herstellung des elektrogesponnenen Fasersubstrate. In flüssigen Medien wird die PLLA-Fasern, PLGA Film-und PLGA Graben aus dem Deckglas als eine Einheit zu trennen. Wenn die PLGA weggelassen wird, wird die PLLA-Fasern nicht eine flache Platte bleiben - sie werden curl up in einem unbrauchbaren Gewirr. So ist die PLGA-Film als ein geeignetes Substrat zur Faserausrichtung während der Kultur pflegen enthalten. Der Graben ist nach dem Schleudern sowohl um sicherzustellen, dass die Fasern fest an den PLGA-Film fixiert und strukturelle Steifigkeit, um den Film add hinzugefügt. Der Graben dient auch als ein nützliches Griff, wenn die Substrate während der Fixierung, Färbung und Montage sind manipuliert. Trituration ist der zweite entscheidende Schritt. Es sollten alle Anstrengungen, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Darüber hinaus haben wir viel höhere Ausbeuten erhalten, wenn ein feuerpolierte Pipette für diesen Schritt verwendet wird. Um Feuer polieren, leichte einem Bunsenbrenner und fügen Sie eine Lampe, um die Pipette. Pass die Spitze der Pipette schnell durch die Flamme 2-3 Mal während kontinuierlich Quetschen und Loslassen der Glühbirne - Luftstrom durch die Pipette wird verhindern, dass die Spitze von ganz geschlossen sein. Untersuchen Sie die Spitze der Pipette, um sicherzustellen, das Loch ist noch offen, und dass die Kanten erscheinen kurz vor Gebrauch abgerundet. Elektrospinnen ist ein sehr vielseitiger Prozess, der Elektrospinnen Parameter können geändert werden, um Fasern mit einer Vielzahl von Morphologien zu erzeugen. Tan et al. (2005) Details einer systematischen Untersuchung von Parametern, die den Durchmesser von PLLA elektrogesponnenen Fasern. Wang et al. (2009) präsentiert eine detaillierte Studie über die Einflussgrößen auf die Ausrichtung der elektrogesponnenen PLLA-Fasern.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PLLA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boehringer Ingelheim</td>
<td>Resomer L210</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PLGA 85:15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>43471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>A2289 
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Apo-transferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Akron </td>
<td>AK8227</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>AC 23009-0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>G0625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7556</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Selenium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>S9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-estradiol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>E 1132 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>H0396</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>C40 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superoxide dismutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>S4636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PSN</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15640 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene </td>
<td>1680149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene </td>
<td>1689149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>26140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optiprep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate </td>
<td>2011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PLL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P4832 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>F 4759 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7906</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-TuJ1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556321</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-neurofilament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>AB1987</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-S100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-NGFR p75</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N3908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal goat serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G6767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>13073-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Prolong Gold +DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36931</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-l-lactide nanofiber scaffolds

Elektrospinnen ist eine Technik zur Herstellung von Mikro-bis Nano-Fasern. Fasern können mit unterschiedlichem Grad der Ausrichtung von hoch zu völlig zufällig ausgerichtet elektrogesponnenen werden. Darüber hinaus können Fasern aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich biologisch abbaubare Polymere wie Poly-L-Milchsäure (PLLA) gesponnen werden. Diese Eigenschaften machen elektroversponnenen Fasern geeignet für eine Vielzahl von Gerüsten Anwendungen im Tissue Engineering. Unser Fokus liegt auf den Einsatz von ausgerichtet elektrogesponnenen Fasern für die Regeneration von Nerven. Wir haben bereits gezeigt, dass ausgerichtet elektrogesponnenen PLLA-Fasern das Auswachsen von primären sensorischen und motorischen Neuronen in vitro zu lenken. Wir behaupten, daß die Verwendung eines primären Zellkultur-System unerlässlich ist bei der Beurteilung Biomaterialien zu modellieren realen Neuronen in vivo so eng wie möglich zu finden. Hier beschreiben wir Techniken, die in unserem Labor verwendet werden, um faserigen Gerüste und Kultur Spinalganglien Explantate sowie dissoziiert sensorischen und motorischen Neuronen, auf elektrogesponnenen Gerüste electrospin. Allerdings sind die Elektrospinnen und / oder Kultur hier vorgestellten Verfahren leicht für die Verwendung in anderen Anwendungen angepasst.

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The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Ausgerichtet elektroversponnenen Fasern direkt das Wachstum von Neuronen in vitro und stellen eine potentielle Komponente der Nervenregeneration Gerüsten. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung elektrogesponnenen Fasersubstrate und das Serum-freie Kultur von primären Ratten-E15 sensorischen (DRG) und motorischen Neuronen. Visualisierung von Neuronen durch Immunzytochemie ist ebenfalls enthalten.

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K Aufrufe.  University of Michigan. Ausgerichtet elektroversponnenen Fasern direkt das Wachstum von Neuronen in vitro und stellen eine potentielle Komponente der Nervenregeneration Gerüsten. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung elektrogesponnenen Fasersubstrate und das Serum-freie Kultur von primären Ratten-E15 sensorischen (DRG) und motorischen Neuronen. Visualisierung von Neuronen durch Immunzytochemie ist ebenfalls enthalten.

Serie: The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Methods Article

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste