Nous remercions les membres de nos laboratoires pour des discussions fructueuses et une assistance technique. Cette présentation vidéo a été soutenue par le doyen associé de la recherche et le Département de biopathologie vétérinaires, Centre de sciences vétérinaires de la santé, de l&#39;Oklahoma State University. La recherche a été financée par le Ministerio de Ciencia e Innovación, l&#39;Espagne (projet BFU2008-01244/BMC), la SCCI projet intra-muros PA1002451 à JF, le Walter R. Sitlington de la chaire de recherche d&#39;aliments pour animaux de KMK, 2009 CVHS CAR subvention, EOA Fonds de la santé animale et de l&#39;USDA, National Research Grant initiative concurrentielle, n ° 2007-04613.

1. Génération d&#39;ARNdb. <ol><li> Synthétiser des amorces oligonucléotidiques contenant des séquences promoteur T7 pour la transcription in vitro et la synthèse d&#39;ARN bicaténaire (par exemple, pour Dermacentor variabilis subolesin utiliser des amorces oligonucléotidiques D8AAT75: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 &#39;et D8DVT73: 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3&#39;). </li><li> Amplifier gène cible par RT-PCR en utilisant 10 pmol de chaque amorce oligonucléotidique et ng 1-10 de l&#39;ARN total de tiques. </li><li> Purifier le produit de PCR. </li><li> Synthétiser ARNdb en utilisant 8 ul du produit de PCR purifié. </li><li> Quantifier ARNdb par spectrométrie. </li></ol> 2. L&#39;injection de tiques avec les ARNdb. 2.1. Préparation de tiques pour l&#39;injection. <ol><li> Tout d&#39;abord, lavez les tiques dans une série de solutions en les secouant dans chaque solution dans un tube à centrifuger jetables de 50 ml, la décantation de la solution à travers un grillage à mailles fines sur le dessus du tube de conserver les tiques. La séquence des solutions pour les tiques de lavage est l&#39;eau du robinet, le peroxyde d&#39;hydrogène à 3%, deux lavages d&#39;eau distillée, éthanol à 70% et plus de deux lavages avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Blot-sécher les tiques sur des serviettes en papier. </li><li> Comptez le nombre de tiques en groupes de 20 à 50, selon l&#39;expérience, placer les tiques de chaque groupe dans une tasse de 1.25 oz en plastique avec un couvercle bien ajusté et l&#39;étiquette avec le numéro du groupe expérimental. </li></ol> 2.2. Cochez l&#39;équipe d&#39;injection. L&#39;équipe de l&#39;ARNi est composé de trois personnes: (1) une personne qui positionne chaque graduation sur ruban adhésif à double apposée sur une feuille de cire dentaire rouge, (2) une personne qui injecte les tiques et (3) une personne qui surveille les tiques après injection, respire de CO 2 sur les tiques pour les activer et compte les tiques qui vivent dans des tasses étiquetés avec le numéro du groupe expérimental. Tous les membres de l&#39;équipe doivent porter des gants jetables. 2.3. Placement de tiques pour l&#39;injection. <ol><li> Capturez une tique avec une pince fine et Dumont place, il la face ventrale sur un ruban adhésif à double apposée sur un 3 &quot;x 6&quot; feuille de cire dentaire rouge. Les tiques sont étroitement positionnés en groupes de 5 ticks. </li><li> Placer une petite bande de ruban-cache sur les pièces buccales de l&#39;ensemble des 5 tiques afin de continuer à les retenir, mais tout en laissant la plupart des corps exposés, afin que le processus d&#39;injection peut être observée par la tique (figure 1) injecteur. </li></ol> 2.4. Injection de tiques. <ol><li> Les tiques seront injectés dans le quadrant inférieur droit de la surface ventrale de l&#39;exosquelette. </li><li> Tout d&#39;abord, percer un trou dans l&#39;exosquelette aide d&#39;une seringue d&#39;insuline Monoject équipé d&#39;un ½ &quot;, une aiguille de calibre 29 (figure 2a). </li><li> Injecter les tiques immédiatement avec 0,2 à 0,5 uL de solution ARNdb (5 x 10 10 - 5 x 10 11 molécules par uL) en utilisant une seringue Hamilton sur-mesure avec un pouce 1, une aiguille de calibre 33 avec un point de 45 ° en biseau (figure 2b) . L&#39;aiguille doit être placée dans la cavité ainsi à cocher pour assurer le placement et le maintien de l&#39;ARNdb. Certains fluides sont susceptibles d&#39;échapper à l&#39;injection (figure 2c). Il faut prendre soin de ne pas injecter le plus les tiques, ce qui entraînerait la perte d&#39;hémolymphe et pourrait causer la mort de la tique. </li><li> Nettoyer la seringue Hamilton après avoir terminé les injections dans chaque groupe expérimental. avant d&#39;utiliser pour un autre groupe expérimental. Remplir la seringue d&#39;abord d&#39;un bécher contenant du peroxyde d&#39;hydrogène à 3%, puis d&#39;expulser dans un conteneur à déchets, et répétez 15 fois. Remplir la seringue d&#39;un bécher contenant de l&#39;eau stérile, puis d&#39;expulser dans un conteneur à déchets, et répétez 15 fois. Prenez soin de ne pas plier le piston de la seringue Hamilton parce que, si courbé, le piston se déplace pas sans heurts et répondre à la douceur des gestes requis pour l&#39;injection de tiques. </li></ol> 2.5. Traitement des tiques après l&#39;injection. <ol><li> Ramassez la tique injecté immédiatement de l&#39;adhésif double collant avec les pinces fines et placez-le dans un récipient de récupération de plastique (environ 6 &quot;x 6&quot; et entouré de ruban adhésif pour éviter l&#39;échappement des tiques). Les tiques seront brièvement inactifs après l&#39;injection, mais devrait bientôt commencer à ramper autour du plat. </li><li> Souffle de CO 2 sur les tiques immédiatement après les placer dans le conteneur de récupération pour aider à activer les tiques. Une fois que les tiques sont rampants et active, la blessure va guérir d&#39;injection rapidement et ils seront plus susceptibles de survivre. </li><li> Comptez le nombre de tiques en fonction du nombre dans chaque groupe expérimental et les placer dans une tasse en plastique étiquetés avec un couvercle bien ajusté. Tiques de remplacement doit être injecté pour remplacer ceux qui sont morts avant toute injection du prochain groupe expérimental. </li></ol> 2.6. Cochez la tenue. <ol><li> Placez les tiques dans une chambre humide (12 h de lumière: photopériode 12 h obscurité à 22-25 ° C et 95% par rapport humidity) et maintenez pendant 1 jour. </li><li> Tiques lieu en tic-alimentation des cellules, une par groupe expérimental, collé à un mouton et de leur permettre de nourrir avec un nombre égal de non-injecté tiques mâle ou femelle (selon le sexe n&#39;a pas été injecté). Tiques femelles qui se nourrissent à la réplétion, ceux qui sont retirés de la brebis après 10 jours d&#39;alimentation ou lorsque les femelles de contrôle ont déposé l&#39;hôte sont collectés et pesés. </li><li> Placez les tiques dans des cartons, et de tenir dans la chambre de l&#39;humidité jusqu&#39;à la fin de la ponte. Évaluer la ponte en pondérant la masse d&#39;œufs produits par toutes les tiques dans le groupe. </li></ol> 2.7. Analyse du phénotype coche, après l&#39;ARNi. <ol><li> Évaluer tic phénotype après la tétée, en déterminant le nombre de tiques qui ont survécu, le poids de tiques, la ponte d&#39;œufs et de la fertilité. Toutefois, d&#39;autres analyses peuvent être effectuées en fonction du gène ciblé et les objectifs de l&#39;étude. </li></ol> 3. Analyse pour confirmer Gene Silencing par RT-PCR. <ol><li> Disséquer les glandes salivaires et les tripes des tiques individuelles des groupes de contrôle injecté et ARNdb injecté après la tétée. </li><li> Extrait d&#39;ARN total à partir d&#39;échantillons tissulaires individuels. </li><li> Analyser transcrits du gène cible dans les tissus individuels en temps réel RT-PCR et normaliser les niveaux d&#39;ARN 16S contre les tiques ARNr en utilisant la méthode genNorm (méthode DDCT mis en œuvre par Bio-Rad édition iQ5 Standard, Version 2.0). </li><li> Exécuter les courbes de dissociation à la fin de la réaction pour s&#39;assurer que seul un amplicon est formé et que le dénaturent amplicons constamment dans la même plage de température pour chaque échantillon. </li><li> Comparez les taux d&#39;ARNm (normalisé les valeurs de Ct) entre le contrôle-injectés et ARNdb injecté tiques en utilisant les étudiants s `test-t (P = 0,05). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Le protocole décrit ici a été utilisée dans notre laboratoire pour l&#39;ARNi dans de nombreuses espèces différentes de tique (tableau 1). Le montant de l&#39;ARNdb injecté dans les tiques varie avec la taille de la tique; grandes espèces de tiques peuvent accueillir un plus grand volume. Tiques de contrôle négatif doit être injecté par un ARNdb indépendants. Plusieurs dsRNA tels que subolesin 14-19,22-25,27-32,34 et bêta-actine 20,21 pourraient être utilisés comme contrôles positifs. Notez qu&#39;il est important de se laver la seringue entre les traitements pour éviter de mélanger des solutions ARNdb. Si le protocole est fait correctement, à moins de 5% de mortalité devrait être obtenu à partir de la procédure d&#39;injection après 24 heures. Un phénotype typique après inactivation génique chez des tiques est montré dans la figure 3 avec un panel de tiques injectées avec des piscines d&#39;ARNdb dans le but de dépister les tiques antigènes protecteurs. <table border="1"><tbody><tr><td> Cochez les espèces </td><td> ARNdb injecté </td><td> Références </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis </td><td> banque d&#39;ADNc, subolesin, l&#39;actine, nucléotidase, la NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, la TPS, l&#39;ubiquitine, vATPase, sélénoprotéines M et W2A, hématopoïétiques cellules souches / progénitrices de type protéine, l&#39;actine sous-unité 26S du protéasome, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> banque d&#39;ADNc, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> TPS, l&#39;ubiquitine, sélénoprotéine, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, protéines de soie flagelliformes, de von Willebrand Facteur </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Annulatus Rhipicephalus </td><td> ubiquitine, subolesin, EF1a, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Cochez espèce dans laquelle le protocole de l&#39;ARNi a été utilisé. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Placement des tiques, face ventrale en place, sur le ruban adhésif à double adhéré à une feuille de cire dentaire rouge. Les tiques sont placés dans des groupes de 5, après quoi une petite bande de ruban adhésif est placé sur les pièces buccales, afin de sécuriser davantage les tiques, tout en permettant l&#39;injecteur d&#39;observer le corps de la tique pendant l&#39;injection. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. La procédure d&#39;injection comprend (a) perçant le quadrant inférieur droit de l&#39;exosquelette tique avec une sy l&#39;insulineRinge munie d&#39;une aiguille 29 gauge, afin de créer un site d&#39;injection, (b) injection immédiate de l&#39;ARNdb à ce site en utilisant une seringue Hamilton avec une aiguille de calibre 33 qui (c) sera très probablement donner lieu à des fuites d&#39;hémolymphe cocher / fluides. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Un panel de six groupes de cocher dans lequel l&#39;ARNi a été utilisé pour dépister les antigènes protecteurs de cocher Amblyomma americanum. Les changements phénotypiques dans les tiques peuvent être vus par rapport à l&#39;ARNi contrôle positif subolesin et le contrôle ARNdb négatifs indépendants. Dans cette expérience, l&#39;effet de l&#39;ARNi sur la mortalité tique, poids, et la ponte de chaque groupe a été analysées statistiquement.

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Biol. 9, 42-42 (2009).</li><li>Zivkovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subolesin+expression+in+response+to+pathogen+infection+in+ticks.">Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks.</a> BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).</li><li>Karim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+tool:+gene+silencing+in+Ixodes+scapularis+eggs+and+nymphs+by+electroporated+dsRNA.">Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA.</a> BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).</li><li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA.">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li><li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies.">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li><li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila.">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li></ol>

Bien d&#39;autres méthodes ont été décrites pour l&#39;ARNi dans les tiques 14, 33, l&#39;injection d&#39;ARNdb décrite ici est la plus largement utilisée dans les deux jeun (tableau 1) et nourris tiques 16,25,34. ARNi a été montré pour être un outil précieux pour l&#39;étude de la fonction des gènes de tiques, la caractérisation de l&#39;interface de tic-pathogène et le dépistage et la caractérisation des antigènes protecteurs tic 14,35. En particulier, l&#39;ARNi est devenu l&#39;outil le plus précieux pour l&#39;analyse fonctionnelle dans les tiques 35. Méthodologiquement, l&#39;ARNi évoluera probablement dans les méthodes plus efficaces qui peuvent permettre inactivation génique dans un grand nombre d&#39;individus. Le mécanisme de l&#39;ARN double brin induite par ARNi dans les tiques doivent être affinés pour contribuer à une meilleure compréhension et l&#39;utilisation de cette approche génétique chez cette espèce 35,36. L&#39;ampleur des effets hors-cible de l&#39;ARNi dans des tiques est également une question importante qui doit être pleinement pris en compte 14,27. Enfin, l&#39;ARNi sera très probablement apporter une contribution globale de l&#39;étude de la régulation des gènes tiques et la biologie des systèmes et le tic-pathogène interface et peut avoir un impact sur le développement de vaccins pour contrôler les tiques et la transmission des agents pathogènes transmis par les tiques.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Access RT-PCR system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A1250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purelink PCR purification kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K3100-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript RNAi kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1626M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red dental wax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72674</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic cups, 1.25 oz and lids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>Various</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Monoject</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fitted with a &frac12;&#x201D;, 29 gauge needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>701SN,33/.375&#x201D;/45DGR</td>
<td>Custom made</td>
</tr>
<tr>
<td>TriReagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>93289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8892</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Real-time PCR detection system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>Several</td>
<td>Please refer to <a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna interference in ticks

Les tiques sont des ectoparasites hématophages n&#39;oblige d&#39;animaux sauvages et domestiques et des humains, et sont considérés comme deux mondial pour les moustiques vecteurs de maladies humaines 1 et les vecteurs les plus importants qui affectent l&#39;industrie du bétail dans le monde 2. Les tiques sont classés dans la sous-classe, Acari Parasitiformes ordre, sous-ordre Ixodida et sont distribués dans le monde de l&#39;Arctique aux régions tropicales 3. Malgré les efforts pour contrôler les infestations de tiques, ces ectoparasites demeurent un problème grave pour la santé humaine et animale 4,5. L&#39;interférence ARN (ARNi) 6 est une approche inverse base d&#39;acides nucléiques génétique qui implique la perturbation de l&#39;expression des gènes afin de déterminer la fonction du gène ou de son effet sur ​​une voie métabolique. Petits ARN interférents (siRNA) sont les molécules effectrices de la voie de l&#39;ARNi qui est initiée par l&#39;ARN double brin (ARNdb) et aboutit à une séquence-spécifique de dégradation des ARNm cytoplasmiques puissants contenant la même séquence que la gâchette ARNdb 7-9. Mécanismes post-transcriptionnels silençage génique initiée par ARNdb ont été découverts dans tous les eucaryotes étudiés jusqu&#39;à présent, et l&#39;ARNi a été rapidement développée dans une variété d&#39;organismes comme un outil de génomique fonctionnelle et d&#39;autres applications 10. L&#39;ARNi est devenu le plus largement utilisé gène-taire technique dans les tiques et les autres organismes où les approches alternatives pour la manipulation génétique ne sont pas disponibles ou ne sont pas fiables 5,11. La caractérisation génétique des tiques a été limité jusqu&#39;à ce que l&#39;application récente de l&#39;ARNi 12,13. Dans le court laps de temps que l&#39;ARNi a été disponible, il s&#39;est avéré être un outil précieux pour étudier la fonction des gènes de tiques, la caractérisation de l&#39;interface de tic-pathogène et le criblage et la caractérisation des antigènes protecteurs tic 14. Ici, une méthode pour l&#39;ARNi par injection d&#39;ARNdb dans les tiques à jeun est décrite. Il est probable que les connaissances acquises de cette approche expérimentale contribuera sensiblement à la compréhension de base des systèmes biologiques et le développement de vaccins pour contrôler les infestations de tiques et de prévenir la transmission du tic-pathogènes 15-19.

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RNA Interference in Ticks

Une méthode pour l&#39;interférence ARN (ARNi) par injection d&#39;ARNdb dans les tiques à jeun est décrite. L&#39;ARNi est le plus largement utilisé gène-taire technique dans les tiques où l&#39;utilisation d&#39;autres méthodes de manipulation génétique a été limitée.

ARN interférence dans les tiques

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K vues.  Oklahoma State University. Une méthode pour l'interférence ARN (ARNi) par injection d'ARNdb dans les tiques à jeun est décrite. L'ARNi est le plus largement utilisé gène-taire technique dans les tiques où l'utilisation d'autres méthodes de manipulation génétique a été limitée.

Vidéo: RNA Interference in Ticks

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Développement d&#39;un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Recherche

Immunologie et infection

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

La salive, les glandes salivaires, et Collection hémolymphe de tiques Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Alimentation des tiques sur les animaux pour la transmission et Xénodiagnostic dans la recherche la maladie de Lyme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

ARN Purification de Intracellulairement Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Dans les cellules macrophages

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...