Cette recherche a été financée par les Instituts de recherche en santé (subvention des IRSC RdP-115195) et FRQ-S à l&#39;informatique, qui est également récipiendaire du Prix du jeune chercheur des IRSC; et le Conseil suédois de la recherche et de la Société suédoise du cancer pour OL

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Cet article décrit un protocole polysome fractionnement bien établie suivie par une méthode d&#39;analyse développés en interne pour la capture des modifications qualitatives et quantitatives de l&#39;activité de traduction à l&#39;échelle du génome dans les cellules de mammifères. Pour la réussite de ce protocole une attention particulière devrait être accordée à 1) Cellule de confluence (comme les taux de prolifération et la disponibilité des éléments nutritifs en corrélation avec l&#39;activité de traduction de l&#39;ARNm et peuvent affecter la composition de la translatome, confluence cellulaire doit être homogène pour les répétitions et les conditions expérimentales), 2) la lyse cellulaire rapide (Malgré la présence de cycloheximide et les inhibiteurs de RNAse dans des tampons, lyse doit être rapide et extraits cellulaires doivent être superposées sur des gradients de saccharose, immédiatement après la lyse de prévenir la dégradation de l&#39;ARN et la dissociation des polysomes), 3) la préparation de gradient (pour s&#39;assurer grande reproductibilité des données, des gradients de saccharose doivent être préparés en utilisant la machine à gradient et spésoins sociale devrait être prise lors de leur manipulation). En plus d&#39;étudier les changements dans l&#39;activité de traduction, ce protocole peut être utilisé pour isoler des complexes protéiques ribosomes associés et établir leurs fonctions physiologiques. A cet effet, les niveaux et l&#39;état de phosphorylation de diverses protéines de ribosomes associés peuvent être déterminés par précipitation au TCA, suivis par transfert de Western, tandis que les complexes protéiques ribosomes associés peuvent être immunoprécipités à partir de fractions de gradient et analysées par Western blot ou spectrométrie de masse. Un inconvénient de cette technique est que la méthode de fraction de gradient lent pourrait entraîner la dissociation des protéines même étroitement liées dont la cinétique de liaison sont en rapide association / dissociation. Les facteurs associés à des polypeptides nouvellement synthétisés sont des exemples typiques. Des polypeptides nouvellement synthétisés émergents former les ribosomes peuvent être immobilisés sur des complexes protéiques associés à des ribosomes à l&#39;aide des agents de reticulation chimiques tels que le 3, 3&#39;-dithiobis [suifosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Cette approche a révélé que le récepteur pour C activée Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / facteur eucaryote d&#39;élongation traduction 1A2 (eEF1A2) complexe régule la dégradation des polypeptides nouvellement synthétisés en réponse au stress 27. En outre, la méthodologie similaire a été utilisée dans des études montrant que la protéine kinase C BII (PKCbII) est recruté pour ribosomes par RACK1 32 et que l&#39;activation du complexe mTOR 2 (mTORC2) se produit sur ​​les ribosomes où elle phosphoryle polypeptides AKT nouvellement synthétisées et réglemente leur stabilité 33,34. Les principales limites de la méthode polysomes de fractionnement, suivi par une analyse de Anota sont les suivants: 1) l&#39;exigence d&#39;un nombre relativement élevé de cellules (~ 15 x 10 6 cellules), 2) l&#39;absence d&#39;une information de position en ce qui concerne la localisation du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné, et 3 ) les questions liées à hétéro cellulaire et moléculairenéité de tissus normaux et tumoraux. Les questions liées au nombre de cellules nécessaires peuvent être résolus par l&#39;alignement des pics des spectres d&#39;absorbance correspondant à monosomes (80S) de cellules dont les montants sont de limiter à ceux obtenus à partir de cellules de haute abondance (par exemple des cellules HeLa) 35. Technique de profilage ribosome (voir ci-dessous) peut être utilisé pour déterminer la position exacte du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné, tandis que les questions liées aux effets de confusion de l&#39;hétérogénéité des tissus sur l&#39;interprétation des changements dans l&#39;expression des gènes obtenus à partir de systèmes complexes tels que les tissus humains sont discutés en détail dans une publication de poireaux et Storey 36. Récemment, une nouvelle technique de profilage ribosome a été développé, dans lequel des fragments de ribosome protégées (PRSA) sont générés par le traitement RNase I et analysés par séquençage profond 22. Cette technique permet de déterminer la position du ribosome à une résolution d&#39;un seul nucléotide, fournissant ainsi jusqu&#39;à UNPRidées ecedented en biologie ribosome. Par exemple, le profilage ribosome peut être utilisé pour la détermination de la densité du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné ou l&#39;identification des éléments que les taux traduction de l&#39;influence d&#39;initiation tels que les sites d&#39;initiation alternatifs, initiation aux codons non-AUG et des éléments de régulation tels que uORFs. Cependant, il existe plusieurs limites méthodologiques qui limitent la capacité de profilage ribosome d&#39;estimer avec précision l&#39;efficacité de traduction de l&#39;ARNm. Il s&#39;agit notamment des biais indépendants introduites par fragmentation aléatoire et RNAse je digestion, les biais introduits par les inhibiteurs de la traduction (par exemple des inhibiteurs allongement tels que l&#39;émétine et cycloheximide sont susceptibles d&#39;induire une accumulation ribosome à des sites d&#39;initiation de la traduction), un grand nombre de faux résultats positifs et faux négatifs associés avec des scores TE ainsi que leur imprécision dans la prédiction du lit qui proviennent d&#39;ARNm codant la protéine 37. Peut-être le plus important, alors queprofilage ribosome permet l&#39;identification directe de la position du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné, le nombre de ribosomes qui est associé à un ARNm donné est estimée indirectement par la normalisation des fréquences de lit dans RPF (ARNm au ribosome-associé) au-dessus de celles observées dans les ARNm de façon aléatoire fragmentés (total ARNm). Par exemple, dans un cadre simple où quatre molécules d&#39;ARNm «B» (Ba, Bb, Bc et Bd) sont occupés par quatre ribosomes dans les positions 1, 2, 3 et 4, une lacune inhérente à la technique de profilage de ribosome ne permettra pas une distinction entre un scénario où les 4 ribosomes associent uniquement avec un Ba ARNm dans les positions 1, 2, 3, et 4 et un scénario où Ba, Bb, Bc et Bd ARNm sont occupées chacune par un seul ribosome à la position 1, 2 , 3, et 4, respectivement. En revanche, au cours de polysomes fractionnement, polysomes intégrité est préservée, ce qui permet l&#39;isolement de pools d&#39;ARNm associées à un nombre défini de ribosomes (figure 1). Cette importationdistinction fourmi entre polysome fractionnement et le profilage ribosome suggère que tandis que la première méthode peut être utilisée pour comparer directement les ARNm dans mRNP, fractions légères et polysomes lourds, cette dernière méthode sera probablement pas à tenir compte des changements dans la translatome qui sont causées par des ARNm que la transition de s&#39;allume pour polysomes lourds, tout en surestimant la contribution de ceux qui passer de la fraction mRNP à polysomes lourds. La signification biologique de ces différences entre les méthodes mentionnées ci-dessus est mise en évidence par une grande partie des données montrant que l&#39;activation de la translation d&#39;un sous-ensemble d&#39;ARNm telles que celles qui sont eIF4E-sensible, de la transition du clair au polysomes lourds, tandis que d&#39;autres, tels que ceux abritant éléments 5&#39;TOP, sont recrutés pour polysomes lourds directement à partir de pools de libre ribosome-ARNm 6. Fait intéressant, la voie mTOR a été montré pour moduler de façon concomitante traduction pour &quot;eIF4E sensible&quot; et une 5&#39;TOP ARNm1. Par conséquent, les différences méthodologiques qui sont discutés ci-dessus peuvent expliquer la discordance apparente de la conclusion d&#39;une étude à l&#39;aide de ribosome profilage 38,39 et polysome fractionnement 24 pour évaluer les effets de l&#39;inhibition de mTOR sur la translatome. En conclusion, les polysomes fractionnement et le profilage ribosome sont des méthodes complémentaires qui fournissent principalement des informations concernant le nombre de ribosomes associés à l&#39;ARNm et de la position du ribosome sur l&#39;ARNm, respectivement. Surtout, malgré les insuffisances et les avantages de ces méthodes, il demeure essentiel que les données de l&#39;ensemble du génome obtenus par les deux procédures sont correctement analysés et fonctionnel et biochimique validés.

Les réseaux de régulation qui contrôlent l&#39;expression des gènes ont été étudiés dans les deux dernières décennies. La grande majorité de ces efforts de recherche axés sur la régulation transcriptionnelle, de sorte que des changements dans les niveaux d&#39;ARNm à l&#39;état stable à l&#39;échelle du génome entier ont été utilisés pour déterminer les profils dits «expression génique». Des études récentes révèlent que les niveaux d&#39;ARNm de l&#39;état d&#39;équilibre correspondent que faiblement à la composition du protéome 1,2, ce qui indique que les mécanismes post-transcriptionnels, y compris la traduction de l&#39;ARNm, jouent un rôle majeur dans la régulation de l&#39;expression génique 3,4. En effet, il a été estimé que ~ 50% des taux de protéines sont déterminés au niveau de la traduction de l&#39;ARNm dans des fibroblastes de souris immortalisées 5. traduction de l&#39;ARNm est un processus hautement régulé au cours de laquelle les ARNm sont traduits en protéines par une action orchestrée des ribosomes, les ARN de transfert (ARNt) et les facteurs accessoires commonly dénommé facteurs de traduction (TFS) 6. La synthèse des protéines est un processus qui consomme le plus d&#39;énergie dans les cellules de mammifères 7 et donc des taux de traduction de l&#39;ARNm globales sont ajustés pour tenir compte de la disponibilité des nutriments et des taux de prolifération des cellules 8. En plus de modifications dans les taux globaux de la traduction de l&#39;ARNm, divers stimuli extracellulaires (par exemple, les hormones et facteurs de croissance), des indices intracellulaires (par exemple les niveaux d&#39;acides aminés) et différents types de stress (par exemple ER-stress) induire des changements sélectifs dans les piscines d&#39;ARNm qui sont cours de traduction (translatome) 6. Selon le type de stimulus, l&#39;activité de traduction de certains, mais pas tous les ARNm sont considérablement affectées, ce qui conduit à des changements dans le protéome qui sont nécessaires pour monter une réponse cellulaire rapide 6. Ces changements qualitatifs et quantitatifs dans le translatome sont pensés pour être médiée par l&#39;interaction entre les facteurs agissant en trans (par exemple, </em&gt; composants de machinerie traductionnelle, les facteurs auxiliaires ou miARN) et cis-éléments (éléments d&#39;ARN ou caractéristiques) présents dans certains sous-ensembles d&#39;ARNm 6,9. Par exemple, des changements dans les niveaux et / ou l&#39;activité de limitation de vitesse initiation de la traduction eIF4E et facteurs eIF2 modulent sélectivement traduction des transcriptions sur la base des caractéristiques spécifiques 5&#39;UTR 6. eIF4E et eIF2 sont nécessaires pour le recrutement de l&#39;ARNm et l&#39;ARNt initiateur au ribosome, respectivement 6. Une augmentation de l&#39;activité de eIF4E renforce sélectivement la traduction des ARNm hébergeant 5&#39;UTR longues et très structurées, y compris ceux codant pour la prolifération et la survie stimule les protéines, y compris les cyclines, c-myc et Bcl-XL 10. À son tour, l&#39;inactivation de eIF2 conduit à la synthèse d&#39;une protéine arrêt global, tout en régulant de manière sélective jusqu&#39;à la traduction des ARNm contenant des inhibiteurs de courtes amont des cadres de lecture ouverts (uORFs) dans leurs 5&#39;UTR, tels que ceux codant maître trégulateurs ranscriptional de la réponse de la protéine dépliée (par exemple ATF4). En réponse à divers stimuli, y compris les nutriments, les facteurs de croissance et les hormones, la cible mécaniste / mammalienne de la rapamycine (mTOR) voie stimule l&#39;activité de eIF4E en inactivant la protéine 4E-liaison (4E-BP) de la famille des suppresseurs de la traduction, alors que la voie MAPK phosphorylé directement EIF4E 6,11. À leur tour, les kinases eIF2α (c.-à-PERK, PKR, HRI et GCN2) inhibent la phosphorylation de eIF2 par sa sous-unité régulatrice eIF2α en réponse à une carence en nutriments, ER-stress et infection par le virus 6,12. Les modifications de l&#39;activité et / ou l&#39;expression de facteurs de transcription, d&#39;autres composants de la machinerie de translation et de facteurs de régulation, y compris miARN ont été observées dans divers états pathologiques y compris le cancer, les syndromes métaboliques, les troubles neurologiques et psychiatriques, et les maladies cardio-vasculaires et rénales 13-19. Collectivement, ces données indiquent que translationnelle moicanismes jouent un rôle essentiel dans le maintien de l&#39;homéostasie de la cellule et que leur abrogation joue un rôle central dans l&#39;étiologie de diverses maladies humaines. Ici, un protocole pour le fractionnement des polysomes par centrifugation sur gradient de saccharose de densité dans des cellules de mammifère, qui est utilisé pour séparer les polysomes monosomes, à partir de sous-unités ribosomiques et messagers particules de ribonucléoprotéines (les mRNP) est décrite. Cela permet une discrimination entre traduit efficacement (associé à polysomes lourds) de mal traduits (associé à polysomes légers) ARNm. Dans ce dosage, les ribosomes sont immobilisés sur la traduction de l&#39;ARNm en utilisant des inhibiteurs d&#39;allongement tels que la cycloheximide 20 et des extraits cytosoliques sont séparés sur 5-50% de saccharose linéaire des gradients de densité par ultracentrifugation. Fractionnement ultérieur des gradients de saccharose permet l&#39;isolement d&#39;ARNm en fonction du nombre de ribosomes se lient à elles. ARN extrait à partir de chaque fraction peut être ensuite utilisée pour déterminerdes changements dans la distribution des ARNm à travers le gradient entre des conditions différentes, de sorte que l&#39;efficacité de translation augmente à partir du haut vers le bas de la pente. Northern blot ou transcription inverse polymérase quantitative de la chaîne (qRT-PCR) sont utilisées pour déterminer les niveaux d&#39;ARNm dans chaque fraction. Alternativement, les fractions contenant polysomes lourds (généralement plus de 3 ribosomes) sont regroupées et les taux d&#39;ARNm de polysomes associés génome entier sont déterminées à l&#39;aide microarray ou séquençage profond. Il est de la plus haute importance de souligner que les niveaux d&#39;ARNm de polysomes associés sont, en plus de la traduction, affecté par des mécanismes de transcription et de post-transcriptionnel qui influent sur ​​les niveaux de ARNm cytosolique 21. Par conséquent, afin de déterminer les différences de translation à l&#39;aide des données de l&#39;ensemble du génome à partir d&#39;ARNm de polysomes associée, il est nécessaire de corriger les effets des étapes de la voie de l&#39;expression des gènes qui sont en amont de traduction 21. Pour permettre une telle correction, ARN cytosolique est préparé en parallèle avec l&#39;ARN de polysome-associé de chaque échantillon et les taux d&#39;ARNm de l&#39;état d&#39;équilibre du génome sont déterminés 21. Actuellement, soi-disant «traduction-efficacité&quot; (TE) marque (c&#39;est à dire le journal de rapport entre les données d&#39;ARNm polysomes associés et les données d&#39;ARNm cytosolique) sont souvent employés pour corriger les effets des changements dans les niveaux d&#39;ARNm cytosolique sur la traduction efficacité d&#39;un compte tenu de l&#39;ARNm 22. Cependant, en utilisant les scores TE pour identifier traduction différentiel est associée à un nombre important de faux résultats positifs et faux négatifs en raison d&#39;une propriété mathématique des scores TE communément appelés corrélation comme faux 27. En effet, une enquête sur les ensembles de données provenant de plusieurs laboratoires indiqué que ces fausses corrélations semblent inévitables lors de l&#39;analyse des changements dans les translatomes 23. Cela a incité le développement de l &#39;«analyse de tr différentiel<html> anslation &quot;(Anota) algorithme, ce qui ne présente pas les inconvénients précités 23. Pendant Anota-analyse d&#39;un modèle de régression est utilisée pour dériver des mesures de l&#39;activité de translation indépendants des niveaux d&#39;ARN cytosoliques. Ces mesures sont ensuite comparées entre les conditions et une statistique est calculée. L&#39;utilisateur a la possibilité d&#39;application d&#39;un procédé de retrait de la variance, ce qui permet d&#39;améliorer la puissance statistique et réduit l&#39;apparition de résultats faussement positifs dans les études avec quelques répétitions 24. De manière significative, il a été récemment démontré que des perturbations dans la translatome capturés par Anota, mais pas les partitions TE, en corrélation avec les changements dans le protéome 25. Par conséquent, il est fortement recommandé d&#39;appliquer l&#39;analyse de Anota pour l&#39;identification des changements de traduction à l&#39;échelle du génome entier. Alors que les fondements théoriques de l&#39;algorithme de Anota ont été discutés en détail précédemment 21,23,26, ici l&#39;accent est mis sur la façon de l&#39;appliquer dans la pratique. ve_content &quot;&gt; En plus de l&#39;étude des changements dans l&#39;activité de traduction de l&#39;ARNm dans la cellule, ce protocole de fractionnement ribosome peut être utilisé pour isoler et biochimiquement et fonctionnellement caractériser-et ribosome complexes protéiques polysomes associés. Cette approche a bien été déployée dans le passé pour identifier complexes qui régissent la stabilité des polypeptides nouvellement synthétisés 27 et / ou sont impliquées dans la phosphorylation des composants de la machinerie traductionnelle. Cette application de la méthode de fractionnement polysome seront également brièvement discutées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

traduction de l&#39;ARNm joue un rôle central dans la régulation de l&#39;expression génique et représente le processus de consommer de l&#39;énergie dans les cellules de mammifères plus. En conséquence, la dérégulation de la traduction des ARNm est considéré à jouer un rôle majeur dans une variété d&#39;états pathologiques dont le cancer. Ribosomes accueillent également les accompagnateurs, qui facilitent le pliage des polypeptides naissants, modulant ainsi la fonction et la stabilité des polypeptides nouvellement synthétisés. En outre, les données indiquent que les ribosomes émergents servent de plate-forme pour un répertoire de molécules de signalisation, qui sont impliqués dans une variété de modifications post-traductionnelles des polypeptides nouvellement synthétisés tels qu&#39;ils ressortent de la ribosome, et / ou des composants de la machinerie de translation. Ici, un procédé bien établi de fractionnement ribosome utilisant la centrifugation en gradient de densité de sucrose est décrite. En collaboration avec les pays développés &quot;Anota&quot; algorithme interne cette méthode permet la détermination directe de différentiel de traduction des ARNm individuels à l&#39;échelle du génome entier. De plus, ce protocole polyvalent peut être utilisé pour une variété d&#39;études biochimiques visant à disséquer la fonction des complexes protéiques associés au ribosome, y compris celles qui jouent un rôle central dans le repliement et la dégradation des polypeptides nouvellement synthétisés.

mTOR est un nœud important du réseau cellulaire qui coordonne les taux globaux de synthèse de protéines à la disponibilité des éléments nutritifs 19. traduction de l&#39;ARNm est régulée principalement à l&#39;initiation étape de limitation de vitesse 6. La proportion de ribosomes engagés dans les polysomes corrélation positive avec les taux d&#39;initiation de traduction 28. Un exemple d&#39;application de la méthode de fractionnement polysome pour étudier le rôle de la signalisation de mTOR dans la médiation des effets de l&#39;insuline sur la traduction de l&#39;ARNm est présenté. A cette fin, des cellules de cancer du sein humain MCF7 ont été maintenues dans du sérum bas et ensuite stimulées par l&#39;insuline seule ou en combinaison avec l&#39;inhibiteur de mTOR site actif Torin1. Les cellules non stimulées qui ont été constamment maintenus en bas sérum, ont servi de contrôle. mRNP, monosome (80S) et des fractions de polysomes ont été séparés en utilisant la méthode polysome de fractionnement. Par rapport aux cellules témoins, l&#39;insuline a induit une augmentation de l&#39;absorbance dans les fractions de gradient correspondantde polysomes, accompagnée d&#39;une diminution concomitante de l&#39;absorbance de la fraction d&#39;monosome (figure 1). Ces résultats montrent que la proportion de ribosomes engagés dans les polysomes l&#39;insuline est augmentée dans les traités par rapport aux cellules témoins, indiquant donc que, comme on s&#39;y attendait, l&#39;insuline stimule les taux globaux d&#39;initiation de traduction. Torin1 inversé les effets de l&#39;insuline sur les profils d&#39;absorbance (Figure 1), ce qui confirme les conclusions que la signalisation mTOR joue un rôle majeur dans la médiation des effets de l&#39;insuline sur la machinerie de traduction 19. Basé sur un principe que les incohérences dans la préparation gradient ne peuvent être évités, des questions ont été soulevées quant à la reproductibilité des données obtenues en utilisant la méthode de fractionnement polysome 22. Pour tester empiriquement cette question potentiellement délétère, cytosolique et ARN polysome associée lourd (ARNm associé à 4 et plus de ribosomes) ont été isolés<html> à partir de cellules MCF7 traitées par l&#39;insuline seule ou en combinaison avec de l&#39;insuline à partir de 4 répétitions Torin1 biologiques indépendants (figure 2). Les effets de l&#39;insuline et Torin1 sur la composition du cytosolique et lourd ARNm polysome associée à chaque répétition a été déterminée sur une échelle du génome entier en utilisant une approche de microarray. Afin de déterminer la reproductibilité de la méthode de fractionnement polysomes l&#39;analyse en composantes principales (ACP) a été appliquée. Cette analyse a montré que les échantillons appartenant à chaque état ​​ont été positionnés fermement dans les deux premiers composants, tandis que les différentes conditions ont été bien séparés (Figure 2). Ces résultats montrent que la méthode de fractionnement polysome comme décrit ici est hautement reproductible et donc d&#39;étudier les changements quantitatifs et qualitatifs de la traduction au niveau de l&#39;ensemble du génome. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Profils polysomal montrant les effets de la privation de sérum, de l&#39;insuline et mTOR signalisation sur la conversion global dans les cellules MCF7. Des cellules MCF7 ont été privées de nutriments (maintenues dans 0,1% de FBS) pendant 16 heures et traitées avec 5 nM d&#39;insuline (Ins), seul ou en combinaison avec 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) pendant 4 heures. Cellules non traitées qui ont été continuellement privés de nutriments (0,1% de FBS) ont été utilisés comme contrôle. Les extraits cytosoliques correspondants ont été sédimentées par centrifugation sur des gradients de 5 à 50% de saccharose. Sous-unités ribosomiques libres (40S et 60S), monosomes (80S) et le nombre de ribosomes dans les fractions de polysomes sont indiqués. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Figure 2. Données Genome-Wide obtenus en utilisant polysome profilage est hautement reproductible. des cellules MCF7 ont été traitées comme dans la figure 1. cytosolique et l&#39;ARN de polysomes-associés (&gt; 3 ribosomes) a été extrait à partir de 4 répétitions biologiques indépendants et leurs niveaux d&#39;ARNm de l&#39;ensemble du génome ont été déterminées en utilisant des tableaux GeneTitan (Affymetrix). PCA a été utilisé pour évaluer la reproductibilité des données résultantes. Présentés sont les deux premiers éléments de l&#39;APC pour tous les traitements (T1 = Torin 1; ctrl = contrôle; Ins = insuline), l&#39;origine de l&#39;ARN (C = cytosolique; P = polysome associé) et réplique. Les échantillons provenant de la même condition et l&#39;origine de l&#39;ARN sont étroitement positionnés indiquant une reproductibilité élevée.

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Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l&#39;efficacité de la traduction des ARNm individuels à l&#39;échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l&#39;analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

Research

JoVE Journal

Biology

68.0K vues.  McGill University.  Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de sign...

Vidéo: Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Biologie

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

L&#39;échelle du génome Analyse des aminoacylation (recharge) Niveaux d&#39;ARNt utilisant des microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Analyse du génome entier en utilisant ChIP d&#39;identifier les gènes cibles spécifiques Isoform

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

Scale-Up de la culture des cellules de mammifères en utilisant un nouveau flacon multicouches

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel bayésienne changement de point Algorithme pour l&#39;échelle du génome Analyse des données ChIPseq divers types de

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...