Matthew O&#39;Sullivan et Fei Zhou sont bénéficiaires de l&#39;Australian National Santé et du Medical Research Council Bourses d&#39;études supérieures de la recherche médicale.

Une attention particulière doit être accordée à l&#39;apprêt et la conception de la sonde. Toutes les séquences disponibles des objectifs d&#39;intérêt à partir des bases de données telles que GenBank devraient être utilisées pour identifier les domaines conservés qui sont des cibles appropriées. Si un grand nombre de cibles sont amplifiées dans un essai MPCR unique, chaque séquence doit être amplifié de longueur similaire, et ne doit pas dépasser 300 paires de base pour éviter la concurrence. Une autre application de la méthode est d&#39;amplifier une cible de plus en utilisant des amorces contre les régions conservées et d&#39;utiliser des sondes multiples pour identifier des variations de séquence dans l&#39;amplicon. Dans ce cas, le produit amplifié par PCR peut être plus long. Températures de recuit Primer devraient tous être semblables, avec des conditions de PCR ajusté en conséquence. Amorces qui forme forte structure secondaire ou dimère primaire doit être évitée. Le Sigma Aldrich ADN calculatrice ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) peut être utilisé pour prédire de façon fiable ces caractéristiques. Des sondes d&#39;ADN devraient être conçus pour avoir recuit des températures proches de 60 ° C. Afin de maximiser la spécificité, deux sondes pour chaque cible d&#39;intérêt peuvent être inclus dans le test, une hybridation à l&#39;avant du brin d&#39;ADN adjacent au site amorce reverse contraignant, et l&#39;autre pour le volet arrière à côté du site amorce sens contraignant. Dans ce cas, les deux amorces avant et arrière doivent être modifiés à la biotine. Si une seule sonde par cible amplifiée est utilisée, alors seulement une amorce besoin biotine modifiée. Lors de la conception des amorces et des sondes pour l&#39;analyse MPCR / RLB, il est fortement conseillé d&#39;utiliser des méthodes in silico pour prédire les produits de PCR et hybridation de sonde la corrélation avec les résultats in vitro. Idéalement cela est fait à partir d&#39;isolats dont la séquence du génome entier est disponible. Des logiciels tels que FastPCR (disponible à http://primerdigital.com/fastpcr.html) peuvent être utilisés à cette fin. Signal de la sonde faible ou absent peut être prédit, où l&#39;analyse in silico indique inadéquation de paires de bases résultant de la température de sonde recuit à basse. Techniques d&#39;extraction d&#39;ADN varie selon les échantillons testés, et les conditions de PCR sera dépendante de conception d&#39;amorce. Les lecteurs sont priés de publications sur des dosages individuels pour plus d&#39;informations concernant l&#39;extraction d&#39;ADN et de réactifs de PCR et les conditions de 1-19. Chaque test est exécuté avec des contrôles appropriés pour fournir au moins un signal positif et négatif pour une sonde de chaque sonde sur la membrane, ainsi que d&#39;un ADN sans contrôle. Par ailleurs, il est avantageux d&#39;inclure une sonde dans la partie supérieure de la membrane qui devrait être positif pour tous les échantillons (ex.: une espèce ou un genre de sonde spécifiques dans le cas d&#39;un micro-organisme). Cela sert d&#39;une sonde contrôle positif, mais elle permet aussi une orientation facile des résultats. 1. Préparation de la membrane <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ul><li> 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4) </li><li> 100 ml de NaHCO 3 0,5 M </li><li> 20 ml EDAC 16% </li><li> 250 ml NaOH 0,1 M </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - lieu en bain-marie à 60 ° C </li><li> 250 ml EDTA 20 mM. </li></ul></li><li> Préchauffer le four à 60 ° C. </li><li> Nettoyez le Miniblotter Immunetics avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Diluer les sondes oligonucléotidiques dans 0,5 M de NaHCO 3 à une concentration finale de 2 pmol / ul et un volume de 200 pl. </li><li> Couper une membrane de nylon BiodyneC à 15x15 cm. En utilisant un crayon et une règle, la règle hors d&#39;un espace de 0,5 cm à travers le dessus de la membrane et donner les détails ici. </li><li> Sceau de membrane dans un sac plastique avec 20 ml solution fraîchement préparée EDAC 16% et de rock à la température ambiante pendant 10 minutes. </li><li> Laver la membrane dans de l&#39;eau déminéralisée pendant 30 secondes. </li><li> Placer dans la membrane miniblotter avec chaînes courir à travers la membrane (parallèle à la ligne de crayon). Mettez coussin de soutien en place et à proximité buvard. Aspirer le fluide de canaux. </li><li> Remplissez les lignes 1 et 45 avec 150 pl 0,5 M de NaHCO 3. Utilisez 150 ul de chaque solution de sonde pour remplir voies 2-44 de la séquence, en faisant attention à éviter les bulles d&#39;air. Si une bulle d&#39;air apparaît dans le canal, en gardant la pipette en place, rapidement aspirer la solution pour permettre à la bulle d&#39;air de flotter au sommet de la pipette, puis réessayez. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Aspirer des solutions de sonde, retirez la membrane et se laver dans 250 ml de NaOH 0,1 M à température ambiante pendant 9 minutes. </li><li> Laver la membrane dans 250 ml 2xSSPE pendant 30 secondes. </li><li> Laver la membrane dans 250 ml pré-chauffé 2xSSPE/0.1% SDS dans un four à 60 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Si ce n&#39;est pas être utilisées pour l&#39;hybridation immédiatement, se laver la membrane dans 240 ml d&#39;EDTA 20 mM à température ambiante pendant 20 minutes (réserver 10 ml restants), puis sceller la membrane dans un sac en plastique avec 10 ml d&#39;EDTA reste 20 mM et de stockagee au réfrigérateur à 4 ° C. </li><li> Lavez miniblotter avec Pyroneg détergent et une brosse. Rincer et laisser sécher. </li></ol> 2. Hybridation et détection <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - magasin au bain-marie à 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - magasin au bain-marie à 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - un magasin dans le four à 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - conserver à température ambiante </li><li> 500 ml SDS à 1% - un magasin au bain-marie à 60 ° C au départ (pour l&#39;étape 3) </li><li> 250 ml EDTA 20 mM - stocker à température ambiante (pour l&#39;étape 3). </li></ul></li><li> Tourner sur un four à 60 ° C et un four à 42 ° C. Porter l&#39;eau à bouillir dans un grand bécher sur une plaque chauffante. </li><li> Nettoyer Immunetics Miniblotter à l&#39;éthanol 70%. </li><li> Aliquote de 10 ml de 2xSSPE/0.1% SDS dans un petit récipient. Ajouter 20 ul de chaque produit de PCR à 150 ul 2xSSPE/0.1% de SDS dans des tubes numérotés. </li><li> Faire bouillir les produits de PCR pendant 10 min à 100 ° C en utilisant les détenteurs de styromousse. Placez-le sur la glace immédiatement pendant au moins 5 minutes. </li><li> Lavez la membrane en restant 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS à 60 ° C au four pendant 5 minutes. </li><li> Placer dans la membrane miniblotter avec coussin d&#39;appui. Orientez donc canaux courir verticalement (perpendiculaire à la ligne de crayon). </li><li> L&#39;excès de liquide d&#39;aspiration des canaux miniblotter. </li><li> Ajouter le reste 150 ul 2xSSPE/0.1% de SDS à des canaux et prénom. Ajouter bouillie produits de PCR à des canaux restants (2-44) dans la séquence, en prenant soin d&#39;éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Miniblotter Placer à plat dans le four à 60 ° C pendant 1 heure pour permettre l&#39;hybridation ait lieu. </li><li> Aspirer liquides à partir de chaque canal puis retirer la membrane du miniblotter. </li><li> Laver deux fois dans préchauffée SDS 250 ml 2xSSPE/0.5% à 60 ° C au four pendant 10 minutes. </li><li> Humidifiez filet de nylon séparant par 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C et l&#39;utiliser pour rouler la membrane. </li><li> Placez retroussé membrane dans le tube d&#39;enroulement, et se déploient pour assurer la membrane bute contre la surface intérieure. Ajouter 3 pi conjugué streptavidine-peroxydase (Roche Applied Science) à 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C et ajouter à tube d&#39;enroulement. Bouchon sur hermétiquement et laisser incuber dans un four à rouleaux à 42 ° C pendant 60 minutes. Assurer la direction du rouleau est telle que la membrane ne pas serrer. Vérifiez périodiquement s&#39;il ya des fuites. </li><li> Lavez miniblotter dans Pyroneg eau et du détergent, rincer et laisser sécher. </li><li> Retirer la membrane du tube d&#39;enroulement. Laver deux fois en restant 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Laver deux fois dans 2xSSPE à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Éteindre le four à 80 ° C et le lieu de 500ml 1% de SDS dans le four à préchauffer. </li><li> Maquillage 15 ml Amersham solution de détection ECL (7,5 ml de solution A et 7,5 ml de solution B). Jeter 2xSSPE et ajouter la solution de détection. Rocher doucement par la main pendant 2 minutes en assurant une couverture complète de la membrane avec une solution. Jeter la solution chimiluminescente. </li><li> Couper deux feuilles de matière plastique transparente pour s&#39;adapter cartouche d&#39;exposition. Placez la membrane entre les deux feuilles et le placer dans la cartouche d&#39;exposition. </li><li> Procéder à la chambre noire. Sous une lumière rouge, ajoutez du film de détection ECL à la cartouche et exposer pendant 5 minutes. Chien-oreille coin inférieur droit d&#39;un film lors de l&#39;enlèvement afin de permettre une orientation correcte lors de la visualisation. </li><li> Développer film avec développeur automatisé ou bains chimiques selon les directives du fabricant. </li><li> Répétez l&#39;exposition avec des temps d&#39;exposition plus longs ou plus courts, si nécessaire. </li></ol> 3. Régénération des membranes <ol><li> Laver la membrane dans 250 ml à 1% de SDS à 80 ° C pendant 30 minutes deux fois. </li><li> Laver la membrane dans 240 ml d&#39;EDTA 20 mM à température ambiante pendant 15 minutes. </li><li> Sceau de membrane dans un sac plastique avec 10 ml d&#39;EDTA 20 mM et réfrigérer à 4 ° C pour une réutilisation future. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Les résultats sont meilleurs vu en plaçant le film sur une grille imprimée, ou bien la numérisation de l&#39;image et l&#39;importer dans un logiciel tel que BioNumerics (Mathématiques appliquées, Sint-Martens-Latem, Belgique). Chaque résultat de la sonde doit être interprété en référence à des sondes de contrôle positif et négatif. Les résultats sont meilleurs classés comme négatifs, faible ou positif. Les résultats positifs sont là où le signal est plus fort ou plus fort que celui de la sonde contrôle positif. Les résultats négatifs sont là où le signal est absent ou égal au contrôle négatif (dans le cas du signal de fond). Faibles résultats sont là où le signal est plus faible que la sonde contrôle positif, mais plus fort que le contrôle négatif. La faiblesse des résultats peut être le résultat de mutations ponctuelles conduisant à la fixation de sonde faible, ou pour cause de non-spécifiques signaux de la formation de dimères d&#39;amorces. L&#39;utilisation de deux sondes par cible d&#39;intérêt peut améliorer la spécificité, où un seul résultat faible peut sans risque être interprété comme signal non spécifique. Si un doute subsiste, une seule réaction complexes PCR peut être effectuée avec du gel à base de détection et le séquençage de n&#39;importe quel amplilified produit pour déterminer si le résultat est vraiment positif. Un résultat représentatif est montré dans la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Les principes MPCR / RLB (P1) Étape 1.9. Amine sondes modifiées sont liés de manière covalente à une membrane de nylon. (P2) Étape 2,10. Biotine modifiés produits de PCR sont hybridés aux sondes. (P3) Étape 2,14. Streptavidine marquée à la peroxydase, est incubé avec la membrane et se lie à la biotine. (P4) étapes 2.19 à 2.21. Peroxydase catalyse une réaction dans les réactifs de détection ECL, produire de la lumière à laquelle la lumière pellicule sensible est exposée. La membrane est ensuite lavée pour la réutilisation. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Représentant MPCR / RLB résultat. Des échantillons de 1 à 6 représentent les contrôles positifs - entre eux, il ya au moins un signal de la sonde positive pour chacun des 43 sondes. Chaque séquence cible (de A à U) est détectée avec deux sondes différentes pour optimiser la spécificité. Sondes A1 et A2 représentent des espèces sondes spécifiques qui devraient être positifs pour chaque échantillon et d&#39;aider à orienter le film. Sonde A1 est répété au bas de la membrane. Les échantillons 7 et 8 sont des contrôles négatifs. Notez que Q1 sondes, T2, T1 et T2 ont signal dans les contrôles négatifs, indiquant probablement une liaison non spécifique des amorces ou un produit dimère d&#39;amorces. Re-conception de ces sondes ou d&#39;amorces serait nécessaire. Sondes C1, D1 et F1 montrent des stries à travers la membrane probablement dû à une certaine absorption non spécifique du conjugué streptavidine-peroxydase ou substrat chimioluminescent, mais cela est facilement distingués des vrais signaux de la sonde positive. Sondes D1 et D2 ont signal relativement faible par rapport à d&#39;autres sondes, cela peut être dû à de plus grands amplicons conduisant à une amplification moins efficace. Sonde J2 est négative est de plusieurs échantillons (1, 3, 4, 6, 39) où la sonde J1 est positif. Il est fort probable représente une mutation dans le site J2 contraignantes pour ces échantillons.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode MPCR / RLB permet la détection simultanée d&#39;un grand nombre d&#39;amplicons de PCR. En raison de la grande sensibilité de chimioluminescence basé sur les sondes de détection, un seul multiplex PCR avec un grand nombre de paires d&#39;amorces peuvent être utilisées pour amplifier l&#39;ADN matrice. Si aucun signal de la sonde sont obtenues avec un ou plusieurs échantillons, effectuer l&#39;électrophorèse sur gel avec tout produit restant PCR peut aider à distinguer si le problème est avec l&#39;amplification PCR ou l&#39;hybridation de la sonde. Lorsque tous les signaux de la sonde sur la membrane sont faibles ou inexistantes, mais l&#39;électrophorèse sur gel indique réussie amplification par PCR, des possibilités incluent des problèmes avec l&#39;étiquetage de la membrane, la régénération incorrecte de la membrane après l&#39;utilisation antérieure, des températures incorrectes lors de l&#39;incubation d&#39;hybridation ou de la streptavidine, ou défectueux streptavidine- conjugué à la peroxydase ou de réactif de détection. Si les échantillons de contrôle indiquent que les sondes individuelles peuvent produire de faux signaux négatifs, seule PCR avec un gel à base de détection et de séquençage ultérieur peut être effectué pour vérifier l&#39;amplification du produit de PCR et de chercher des variations de séquence sur le site de la sonde contraignant. Signal de la sonde faible ou absent peut être dû à la taille de l&#39;amplicon grande: si possible tous les amplicons doivent être de longueur similaire et moins de 300 pb. Structures d&#39;ADN secondaire d&#39;amplicons peuvent également produire contraignante sonde pauvres, et peut nécessiter une nouvelle conception d&#39;amorces. Apprêt individuels ou les concentrations de sonde peut également être modifiée afin d&#39;optimiser la puissance du signal. Faux signaux positifs en raison de la sonde contraignante d&#39;amorces nonamplified ou une amorce-dimère produit peut être étudié en effectuant seule PCR avec un gel à base de détection et de séquençage ultérieur. Si cela se produit, la refonte des sondes peut être nécessaire. Des mutations ponctuelles dans les sites de la sonde de liaison peuvent conduire à des signaux faibles ou absents. Permettre deux sondes pour chaque produit amplifié rend cela facile à détecter. Cette caractéristique peut être exploitée avec un apprêt et une conception rigoureuses sonde pour détecter des variations de séquence d&#39;ADN cible dans les petites. En résumé, alors qu&#39;il existe de nombreuses méthodes de détection des produits réactions suivantes PCR multiplex disponibles, MPCR / RLB a l&#39;avantage d&#39;être à haut débit et peu coûteuse avec de faibles coûts de configuration-. La souplesse de la méthode permet son utilisation dans une large gamme d&#39;applications.

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 5 &#39;amine C6 modifiés sondes oligonucléotidiques </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> Solution 0,5 M fait jusqu&#39;à un pH de 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M solution de </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampon </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Dodécylsulfate de sodium (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Maquillage solution stock à 10%, ne autoclave, devraient être conservés pendant une semaine maximum avant utilisation </td></tr><tr><td> Éthylènediaminetétraacétique (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Maquillage solution 0,5 M ajusté à pH 8,0 et autoclaver </td></tr><tr><td> N-(3-diméthylaminopropyl)-N &#39;-éthylcarbodiimide (ACDE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Préparez une solution de 20 ml de 16% juste avant l&#39;utilisation en utilisant 3,2 g EDAC et 18 ml d&#39;eau Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 cm à membrane en nylon um 20x20 </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Déminéralisée, eau purifiée </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Détergent liquide Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-peroxydase </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL réactifs de détection </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL réactifs de détection </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Transparence du film OHP </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL hyperfilm haute performance des films chimiluminescents 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Glace </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Consommables utilisés dans l&#39;essai MPCR / RLB. <table border="1"><tbody><tr><th> Équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Fours Shake&#39;n&#39;Stack Hybaid (2) bouteilles de laminage et de filet de nylon séparant </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Cette méthode peut être réalisée avec un seul four tant qu&#39;il y est facilité pour la maintenance de solutions à 42 ° C et 60 ° C avant utilisation </td></tr><tr><td> La plate-forme à bascule Belly Dancer </td><td> Stovall sciences de la vie </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Bain-marie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aspiration </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plaque de cuisson </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cartouche d&#39;exposition </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Développeur du film X-ray </td><td></td><td></td><td> Pouvez également utiliser révélateur, fixateur et eau dans des plateaux dans une pièce sombre au lieu d&#39;automatiquedéveloppeur. Lumino-imageur peut également être utilisé à la place du film Xray </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Matériel nécessaire pour le dosage MPCR / RLB.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

PCR multiplex / test d&#39;hybridation inverse Ligne Blot permet la détection de jusqu&#39;à 43 cibles moléculaires dans 43 échantillons en utilisant une PCR multiplex de réaction suivie par hybridation de sonde sur une membrane de nylon, qui est ré-utilisable. Les sondes sont 5 &#39;amine modifiée pour permettre la fixation à la membrane. Les amorces sont 5 &#39;biotine modifiée qui permet la détection de produits de PCR utilisant hybridées streptavidine-peroxydase et un substrat chimiluminescent via un film photosensible. Avec une configuration faible et les coûts de consommables, cette technique est peu coûteuse (environ 2 $ US par échantillon), à haut débit (plusieurs membranes peuvent être traitées simultanément) et dispose d&#39;un délai court (environ 10 heures). La technique peut être utilisée dans un certain nombre de façons. Plusieurs sondes peuvent être conçus pour détecter des variations de séquence dans un seul produit amplifié, ou plusieurs produits peuvent être amplifiés simultanément, avec un (ou plusieurs) des sondes utilisées pour la détection ultérieure. Une combinaison des deux approches peuvent aussi être utilisés dans un seul test. La possibilité d&#39;inclure plusieurs sondes pour une séquence cible unique permet le dosage très précis. Les applications publiées du MPCR / RLB comprennent la détection des gènes de résistance aux antibiotiques 1,2, tapant du Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline 3-5 et Salmonella sp 6, sérotypage moléculaire de Streptococcus pneumoniae 7,8, 9 et Streptococcus agalactiae entérovirus 10,11, l&#39;identification de Mycobacterium sp 12, la détection des organes génitaux 13-15 et 16 voies respiratoires et d&#39;autres 17 agents pathogènes et de détection et d&#39;identification des mollicutes 18. Toutefois, la polyvalence de la technique des moyens les applications sont quasiment illimitées et ne se limite pas à l&#39;analyse moléculaire des micro-organismes. Les cinq étapes de MPCR / RLB sont un Primer) et la conception de la sonde, b) l&#39;extraction d&#39;ADN et la PCR d&#39;amplification c) Préparation de la membrane, d) Hybridation et détection, et e) La régénération de la membrane.

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Un peu coûteuse, la méthode à haut débit pour la détection simultanée de jusqu&#39;à 43 cibles moléculaires est décrit. Applications de MPCR / RLB comprennent tapant microbienne et la détection de pathogènes multiples à partir d&#39;échantillons cliniques.

PCR multiplex et de test d&#39;hybridation inverse Ligne Blot (MPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.3K vues.  University of Sydney. Un peu coûteuse, la méthode à haut débit pour la détection simultanée de jusqu'à 43 cibles moléculaires est décrit. Applications de MPCR / RLB comprennent tapant microbienne et la détection de pathogènes multiples à partir d'échantillons cliniques.

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Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Toxicité cellulaire des Nanogenomedicine dans la lignée cellulaire MCF-7: test MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Recherche

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec