Nous tenons à remercier T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, et B. Wallek au Lynntech, Inc pour l&#39;assistance technique et de nombreuses discussions utiles. Ce travail a été soutenu par le US National Science Foundation (NSF) titre de la subvention CBET-0933688.

1. Conception de base du Thermocycleur convective <ol><li> Nous avons construit un dispositif simple, thermocyclage convectifs composé de plastique interchangeables chambre de réaction &quot;cartouches&quot; qui sont pris en sandwich entre deux plaques d&#39;aluminium dont les températures sont contrôlées indépendamment 7 (figure 2). </li><li> Puits réacteur cylindrique sont intégrés par des réseaux de l&#39;usinage des trous dans des blocs en polycarbonate, avec différentes combinaisons de diamètre du trou et l&#39;épaisseur de feuille de plastique utilisées pour atteindre les ratios d&#39;aspect souhaité (hauteur / diamètre = h / j). Deux géométries différentes sont considérées comme des réacteurs dans les résultats présentés ici: H / D = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 volumes uL; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 uL volume. </li><li> La surface inférieure du réacteur est chauffé à l&#39;aide d&#39;un bloc d&#39;aluminium contenant cartouches chauffantes interfacé avec un contrôleur de température microprocesser entraînée. </li><li> La température à la surface supérieure du réacteur est régulée à l&#39;aide d&#39;un bloc en aluminium relié à un bain d&#39;eau de recirculation. </li><li> L&#39;ensemble est serré ensemble à l&#39;aide des vis en nylon pour limiter la conduction thermique entre les blocs en aluminium adverse. </li></ol> 2. Préparation et chargement du mélange de réaction PCR <ol><li> Un typique de 100 uL mélange réactionnel contient 10 uL d&#39;une solution tampon 10x, 6 pl de 25 mM MgCl 2, 10 pi de dNTP (2 mM chacun), 41,2 uL d&#39;eau DI, 10 pi de β-actine de sonde, 10 pi de β -actine amorce directe, 10 uL d&#39;amorce reverse β-actine, 2 pl de l&#39;ADN matrice génomique humaine (10 ng / uL) et 0,8 uL d&#39;ADN polymérase KOD (2,5 unités / uL). </li><li> Avant de charger les réactifs, de sceller la surface inférieure de la chambre de PCR en utilisant une feuille mince de ruban adhésif aluminium. </li><li> Rincer les puits avec un réacteur de 10 mg / ml de solution aqueuse d&#39;albumine sérique bovine suivie par Rain-X anti-buée. </li><li> Réactifs pipette dans les puits de réacteur utilisant de longues pointes de pipettes de gel de chargement et de sceller la surface supérieure avec Téflon FEP bande. </li></ol> 3. L&#39;exécution de la réaction dans le thermocycleur convective <ol><li> Avant le début de la réaction, des blocs en aluminium à la fois pour préchauffer les températures souhaitées surface supérieure et inférieure. </li><li> Sandwich du réacteur en plastique chargé de réactifs de PCR entre les blocs de chauffage en aluminium, et rapidement pince l&#39;assemblage ainsi que l&#39;aide de vis en nylon. </li><li> Après la réaction s&#39;est produite pendant le temps voulu, éteindre le chauffe et le lieu de la plus faible (à chaud) de surface de l&#39;appareil au sommet d&#39;un bloc de métal refroidi rapidement le refroidir et arrêter le flux de convection. </li><li> Retirez le réacteur en plastique et la pipette les produits hors des puits (en utilisant les astuces à long chargement de gel) pour une analyse ultérieure. </li></ol> 4. Exécution d&#39;une analyse électrophorèse sur gel <ol><li> Préparer un 2% en poids gel d&#39;agarose par chauffage de 10 g d&#39;agarose avec 500 ml de tampon 1x sur une plaque chaude jusqu&#39;à agitant la solution devient limpide. </li><li> Chargez le gel d&#39;agarose dans le bac de coulée et d&#39;insérer le peigne. Soit l&#39;ensemble de gel pour ~ 30 min. </li><li> Retirer le peigne et ajouter 1x tampon TAE jusqu&#39;à ce que le gel est immergé. </li><li> Fluorescence des échantillons d&#39;ADN teinté contiennent 2 uL 100x SYBR Green I solution, deux échantillons d&#39;ADN ul, 2 ul Dye 6x Chargement d&#39;Orange, et 4 pi de tampon TAE. </li><li> Ajouter les échantillons d&#39;ADN dans les puits et exécuter la séparation à 60 V pendant 1 h avec un 100 pb d&#39;ADN échelle de marqueur de taille. </li><li> Retirer le gel et le photographier sous lumière UV afin d&#39;obtenir le résultat. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La conception optimale des thermocycleurs convection consiste à choisir la géométrie du réacteur correcte qui va générer un flux circulatoire capable de transporter des réactifs à travers les températures clés impliqués dans le processus de PCR. Les paramètres géométriques qui peuvent être modifiées dans les réacteurs cylindriques considérés ici sont la hauteur (h) et le diamètre (d), ou de manière équivalente le ratio d&#39;aspect (h / j). Nous avons exploré les champs d&#39;écoulement 3-D à l&#39;intérieur par convection réacteurs PCR sur une gamme de ratios d&#39;aspect différent en utilisant la dynamique des fluides computationnelle (DFC), et a constaté que les modèles complexes peuvent surgir inopinément. Plus important encore, notre analyse a révélé un sous-ensemble de ces champs d&#39;écoulement complexes que d&#39;accélérer considérablement la réaction 12. Ces effets géométriques peuvent être clairement visible en comparant les champs d&#39;écoulement dans les réacteurs à rapport d&#39;aspect élevé et bas. Dans le cas allongement élevé (H / D = 9; un grand cylindre maigres), des éléments fluides sont advecté le long de trajectoires traçant des chemins qui sont essentiellement des boucles fermées, et ils sont immobilisés à suivre les mêmes chemins pour de longues périodes de temps (figure 3a). Par conséquent, il ya peu d&#39;opportunités pour l&#39;échange entre ftrajectoires basses qui exposent les réactifs à la séquence optimale des conditions thermiques pour la PCR (oscillant entre le recuit et la dénaturation extrêmes à faces supérieure et inférieure du réacteur) et l&#39;ensemble beaucoup plus vaste de trajectoires restants qui ne contribuent pas à l&#39;amplification (localisés près du centre du réacteur). Le champ d&#39;écoulement est très différente à un ratio plus petite dimension (h / j = 3; une plus courte, plus large cylindre), de plus en plus chaotique dans le sens où les trajectoires élément liquide ne suivent plus les chemins fermés (figure 3B). Ainsi, même si les réactifs sont soumis à un profil de température plus complexes, des éléments de fluide sont en mesure d&#39;explorer un éventail beaucoup plus large de trajectoires afin que davantage de volume de réactif a l&#39;occasion d&#39;une expérience optimale de profils thermiques. Ces résultats suggèrent que les contre-intuitivement tout en trajectoires individuelles à des flux h / d = 9 semblent être plus favorables pour la PCR en produisant des profils de température qui &quot;regarde&quot; similaires à celles employées dans un thermocycleur conventionnel, la nature chaotique du champ d&#39;écoulement à h / d = 3 domine finalement à l&#39;échelle mondiale par la promotion de l&#39;échange amélioré de façon que les réactifs ne sont piégés dans des trajectoires défavorables pour très longtemps. Pour tester cette hypothèse et déterminer la géométrie du réacteur a été plus favorable pour la PCR, nous avons utilisé deux d&#39;entre eux pour effectuer la réplication de PCR de 295 pb d&#39;une cible associée avec le gène β-actine à partir d&#39;un modèle d&#39;ADN génomique humain. Fait remarquable, nous avons systématiquement réalisé l&#39;amplification du produit cible correct dans seulement 10 min à H / D = 3 (figure 4a), tandis que la même réaction nécessaire au moins 20 minutes avant que les produits détectables ont été observés à H / D = 9 (figure 4b) . La spécificité de la réaction est aussi beaucoup plus grande à H / D = 3 où un seul produit PCR est obtenu, alors que plusieurs produits non spécifiques sont générés à H / D = 9, où les pièges champ d&#39;écoulement de fluide dans les éléments défavorables trajectoires thermiques pour des périodes de temps prolongées. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Convection thermique dans une chambre cylindrique dont le haut et le bas des surfaces sont maintenus à différentes températures fixes. Si la température à la surface inférieure est plus élevé que dans la partie supérieure, un gradient de densité verticale est établi dans le fluide, enfermé qu&#39;il est capable de générer un modèle de flux circulatoires. Avec le bon choix des paramètres géométriques (hauteur h et de diamètre d), le champ d&#39;écoulement de convection peut être exploité pour actionner thermocyclage PCR lorsque les surfaces supérieure et inférieure sont manintained près de recuit et la dénaturation des températures, respectivement (la gravité agit verticalement vers le bas). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. (A) Les éléments clés d&#39;un flux de convection PCR thermocycleur. Une cartouche de réacteur est constitué d&#39;un bloc de polycarbonate contenant un tableau de chambres cylindriques. Le bloc est pris en sandwich entre une plaque supérieure conçu pour être relié à un bain d&#39;eau circulant et une plaque inférieure incorporant chauffages intégrés. (B) Les réactifs de PCR sont chargés et scellés à l&#39;intérieur de la cartouche de réacteur, après quoi l&#39;appareil est assemblé pour effectuer la réaction. À la fin, le procucts peut être facilement pipette pour analyse ultérieure. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Simulations de calcul de la 3-D des champs d&#39;écoulement convectif générés à l&#39;intérieur des réacteurs cylindriques avec des températures de 53 et 96 ° C imposées sur les surfaces supérieure et inférieure, respectivement. Les résultats sont présentés au rapport d&#39;aspect de (a) H / D = 9 (38,2 uL volume du réacteur) et (b) h / d = 3 (18,5 volume du réacteur uL). Une trajectoire suivie par un représentant élément fluide traversant le champ d&#39;écoulement 3D est affiché à gauche ainsi que des projections vue de dessus et d&#39;autre du chemin, le tracé correspondant de la température en fonction du temps suite à un élément de fluide est indiqué à droite. Le profil thermique à H / D = 9 apparaît proche de celle d&#39;un thermocycleur classique, mais le champ d&#39;écoulement chaotique à H / D = 3 est contre-intuitivement plus favorable pour la PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Résultats de la figure 4. Réplication de l&#39;ADN obtenu dans les géométries de réacteur de la figure 3 (surfaces supérieures et inférieures ont été maintenus à 53 et 96 ° C, respectivement). (A) La PCR est fortement accélérée au H / D = 3, comme en témoigne les produits solides visibles après seulement 10 minutes de temps de réaction (M: 100 échelle de pb, pistes 1-4: les produits de réactions en parallèle dans 4 différentes chambres cylindriques). (B </strong&gt;) La même réaction effectuée à H / D = 9 exige au moins 20 minutes avant que les produits visibles sont observées, et plusieurs bandes sont évidents indiquant la réplication de l&#39;ADN cible non-spécifiques, en plus de produit souhaité (M: 100 pb échelle, voies 1-2: produits de réactions parallèles dans deux différentes chambres cylindriques).

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L&#39;interaction entre le flux et la réaction chimique peut changer de façon spectaculaire sous l&#39;influence de l&#39;advection chaotique. Mais ces états d&#39;écoulement complexes sont difficiles à étudier, notamment dans des géométries réalistes où les effets 3D deviennent importants. Convection de Rayleigh-Bénard à h / j&gt; 1 ne fournit pas seulement une plate-forme pratique pour explorer ces phénomènes, leur application pour effectuer la PCR permet également le couplage entre les réactions chimiques de flux et d&#39;être sondé. Cette capacité unique permet de sélectionner états de flux optimale où chaotiques Loi effets (contre-intuitivement) pour accélérer le taux de réplication de l&#39;ADN.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

Beaucoup de tests de biologie moléculaire dépendent d&#39;une certaine manière sur la réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour amplifier un échantillon cible d&#39;abord diluer l&#39;ADN à un niveau de concentration détectable. Mais la conception de matériel thermocyclage PCR conventionnelle, essentiellement basée sur massifs blocs de chauffage métallique dont la température est régulée par des radiateurs thermoélectriques, limite sévèrement la vitesse de réaction possible 1. Considérable d&#39;énergie électrique est également nécessaire pour chauffer et refroidir plusieurs reprises le mélange réactif, limitant la capacité de déployer ces instruments dans un format portable. La convection thermique est apparue comme une approche alternative prometteuse thermocyclage qui a le potentiel pour surmonter ces limitations 2-9. Flux de convection sont monnaie courante dans un large éventail de paramètres allant de l&#39;atmosphère terrestre, les océans, et l&#39;intérieur, de lampes à lave décoratif et coloré. Mouvement fluide est lancé de la même manière dans chaque cas: une instabilité de flottabilité conduit survient quand un volume confiné de liquide est soumis à un gradient de température spatiale. Ces mêmes phénomènes offrent un moyen attractif pour effectuer thermocyclage PCR. En appliquant un gradient de température statique à travers une géométrie du réacteur bien conçu, un flux circulatoire continu peut être établi que le transport sera répétée réactifs de PCR à travers des zones de température associée à la dénaturation, d&#39;hybridation et les étapes d&#39;extension de la réaction (figure 1). Thermocyclage peut donc être actionné de manière pseudo-isotherme en tenant simplement deux faces opposées à des températures fixes, en éliminant complètement la nécessité de chauffer et de climatiser plusieurs reprises l&#39;instrument. Un des principaux défis de conception de thermocycleurs convection est la nécessité de contrôler avec précision la vitesse spatiale et les distributions de température dans le réacteur afin de s&#39;assurer que les réactifs de façon séquentielle occuper les zones de température correcte pour une période de temps suffisante 10,11. Nous décrivons ici les résultats de nos efforts pour sonder la pleine vitesse de 3-D et les distributions de température dans microéchelle convectifs thermocycleurs 12. De façon inattendue, nous avons découvert un sous-ensemble des trajectoires d&#39;écoulement complexes qui sont très favorables pour la PCR en raison d&#39;une combinaison synergique de (1) échange continu entre les chemins d&#39;écoulement qui offre une possibilité accrue pour les réactifs à l&#39;échantillon de la gamme complète des profils de température optimale, et ( 2) l&#39;augmentation du temps passé dans la zone de température d&#39;extension de l&#39;étape limitante de la PCR. Extrêmement rapide temps de l&#39;amplification d&#39;ADN (de moins de 10 min) sont réalisables dans des réacteurs conçus pour générer ces flux.

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Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Nous décrivons une nouvelle méthode pour effectuer la réplication d&#39;ADN par la réaction de polymérase en chaîne (PCR). Convection thermique est mise à profit pour les réactifs de navette continue entre dénaturation, d&#39;hybridation et les conditions d&#39;extension par le maintien des surfaces opposées du réacteur à température constante. Cette conception intrinsèquement simple, promet de faire rapidement PCR plus accessible.

Rapide par PCR en utilisant thermocyclage Microscale convection thermique

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

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JoVE Journal

Biology

22.6K vues.  Texas A&M University. Nous décrivons une nouvelle méthode pour effectuer la réplication d'ADN par la réaction de polymérase en chaîne (PCR). Convection thermique est mise à profit pour les réactifs de navette continue entre dénaturation, d'hybridation et les conditions d'extension par le maintien des surfaces opposées du réacteur à température constante. Cette conception intrinsèquement simple, promet de faire rapidement PCR plus accessible.

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Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Génotypage rapide des tissus de souris en utilisant Sigma Extract-N-Amp PCR Kit Tissu

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

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Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Optimisé basé sur la PCR Détection de Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

Détecter le Spirochete de la maladie de Lyme, Borrelia Burgdorferi, chez les tiques à l’aide de la PCR nichée

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...