1. Le Thermo Scientific Solaris qPCR algorithme de conception de dosage <ol><li> L&#39;algorithme utilisé dans la conception de Solaris qPCR sonde / amorce paires ajuste la Tm de chaque composant ainsi des conditions favorables à vélo universels. Incorporation de la MGB, ou la reliure petit sillon, fraction de la sonde augmente la Tm et permet de sondes plus courtes pour être conçus pour une plus grande souplesse d&#39;analyse et de performance. Comme leur nom l&#39;indique, BTP sont une classe d&#39;antibiotiques qui peuvent s&#39;insérer dans le petit sillon de la double hélice d&#39;ADN. BTP sont fixés à l&#39;extrémité 3 ou 5 d&#39;une sonde d&#39;ADN. En solution, la fluorescence du reporter FAM de la sonde est trempée par Eclipse Quencher foncé. Lorsque la sonde se lie à une séquence cible, le changement résultant dans 3-D de la sonde s conformation permet à un signal fluorescent intense. La liaison de la sonde d&#39;ADN à séquence cible est stabilisée par le MGB, qui permet l&#39;utilisation de sondes très spécifiques, plus courts, tout en maintenant la température de fusion appropriéepour la PCR. Ainsi, la détection du signal se produit pendant la phase de recuit de l&#39;amplification de cible. Au cours de l&#39;étape d&#39;extension, la sonde MGB dissocie et la fluorescence est de nouveau arrêtée. Parce que la sonde se dissocie, elle n&#39;affecte pas l&#39;efficacité de PCR. </li><li> Une autre caractéristique de l&#39;algorithme de Solaris est l&#39;utilisation de superbases. Superbases sont des bases modifiées qui ont amélioré les capacités de liaison pour améliorer la stabilité des liaisons AT et éliminer GG auto-association de séquences riches en guanine. En outre, ils n&#39;ont pas étancher fluorophores adjacents attachés à l&#39;extrémité 5. Ces bases sont placés de manière sélective, en fonction de l&#39;algorithme, pour accroître la disponibilité de séquences cibles. Il est ainsi possible d&#39;utiliser des séquences, telles que les régions riches en GC, qui autrement seraient évités dans la conception des amorces et des sondes. </li><li> Chaque fois que possible, l&#39;algorithme de Solaris intègre jonction exon couvrant les régions dans le site cible. Cette spécificité augmente en évitant l&#39;amplification of ADN génomique contaminant. </li><li> Surtout, l&#39;algorithme identifie également une séquence consensus pour tous les variants d&#39;épissage connus, tels que tous sont couverts par une seule sonde / amorce ensemble. Donc, un seul test est nécessaire pour un gène d&#39;intérêt particulier. </li><li> Enfin, l&#39;algorithme Solaris qPCR conception test utilise des paramètres très stricts pour des considérations de conception critiques, y compris la teneur en GC, longueur, Tm, et s&#39;étend de nucléotides homogènes. Les séquences obtenues sont analysées pour BLAST spécificité en utilisant 3 bases de données différentes: génomique, la transcription, et pseudogène. </li></ol> 2. L&#39;obtention de réactifs Solaris <ol><li> Pour obtenir les réactifs Solaris appropriée, visitez <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Une fois sur le site cliquez sur &quot;Recherche produit GENEius&quot;. Pour aller directement à la recherche de produits GENEius, allez à <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">l&#39;adresse www.thermo.com / Solaris</a>Rechercher </li><li> Cliquez dans la zone de recherche, et choisissez l&#39;organisme cible appropriée. </li><li> La recherche de produits GENEius peut traiter de nombreux identificateurs de gènes différents. Ici, entrez l&#39;un des termes de recherche suggérés pour trouver le gène d&#39;intérêt, y compris Ref Seq adhésion, l&#39;ID de Gene, le symbole Gene, une description de Gene, l&#39;ID de Sanger ou le numéro d&#39;accession, ou un numéro de catalogue. Puis, cliquez sur &quot;Recherche&quot;. </li><li> Identifier le gène d&#39;intérêt et cliquez sur &quot;Select&quot; sur le côté gauche. Cela va ouvrir une fenêtre qui affiche les différents produits Thermo Scientific disponibles pour le gène d&#39;intérêt. Sous la rubrique «Produits» sélectionnez l&#39;option &quot;Détection qPCR&quot; Tab. </li><li> Dans le cadre du &quot;test Solaris Gene Expression» en-tête, vous verrez une conception optimale Solaris sonde / test primaire. Ce test on va couvrir tous les variants d&#39;épissage connus de votre gène cible. Choisissez la quantité désirée. Ils sont disponibles en 100, 200, 400 et 1000 X 25 pi de réactions (comme si ledire est identifié comme étant faite sur commande, la taille paquet de 100 ne seront pas disponibles). Cliquez sur &quot;Ajouter au panier&quot;. </li><li> Ensuite, sélectionnez le master mix approprié pour le thermocycleur qui sera utilisé. Pour déterminer quel master mix qui fonctionnera le mieux avec la machine disponible, cliquez sur «En savoir Mix Master qui fonctionne le mieux avec votre Cycler PCR!&quot; </li><li> Trouvez le cycleur qPCR qui sera utilisé dans le menu afin de déterminer qui se mélangent à utiliser. </li><li> Revenez à la fenêtre de recherche de produits GENEius, et sélectionnez le master mix approprié. Le master mix est disponible en 100, 200, 400, et 1000 tailles réaction. Cliquez sur &quot;Ajouter au panier&quot;. </li><li> Gènes de référence proposées et des kits verso de synthèse d&#39;ADNc peut également être ordonnée pour une complète qRT-PCR. </li><li> Lorsque les réactifs Solaris qPCR arrivent, les stocker à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Les réactifs suivants doivent être reçues: Une solution 20X contenant deux amorces fournies à 800 nm chacune et une sonde d&#39;un gène spécifique prévu à 200 nm, SequInformations référence pour la sonde et les amorces, et Solaris Gene Expression qPCR Master Mix 2X à une concentration. Solaris analyses qPCR l&#39;expression des gènes sont stables pendant une durée minimale de 12 mois. Eviter les congélations répétées décongélation. </li></ol> 3. configuration qPCR <ol><li> Commencer le protocole qPCR avec l&#39;ADNc. L&#39;ARN total doit être extrait à l&#39;aide d&#39;une méthode de la colonne. Le Thermo Scientific kit de synthèse d&#39;ADNc Verso est recommandé pour la transcription inverse pour produire l&#39;ADNc. </li><li> Préparez-vous pour qPCR par la fonte des amorces, des sondes, et le mélange maître sur la glace. Également avoir sous la main l&#39;eau de qualité PCR et qPCR blanches opaques plaques, ce qui peut améliorer la sensibilité de la PCR en temps réel. </li><li> Le mélange maître contient tous les composants pour PCR en temps réel, notamment: 1) l&#39;ADN polymérase Thermo-Start, une version de démarrage à chaud de l&#39;ADN polymérase Thermoprime. Ce type de polymérase est utilisé pour prévenir une amplification non spécifique au cours de la réaction permet de configurer et nécessite étape d&#39;activation à 95 ° C15 min. 2) dans le mélange dNTP Solaris Maître, dTTP remplace dUTP pour maximiser l&#39;efficacité d&#39;amplification 3) tampon de réaction exclusif, optimisé pour fonctionner avec Solaris amorce / sonde essais. Ce tampon de réaction contient un colorant bleu pour augmenter le contraste entre le réactif et le plastique. 4) ROX, si votre instrument qPCR nécessite ROX. </li><li> Une fois que les solutions sont décongelés, mélanger en tapotant le tube (ne pas vortexer). Isoler les pour éviter la perte de réactif. </li><li> Ensuite, préparez un tube de 15 ml Falcon stérile pour mettre en place le mélange réactionnel pour le gène d&#39;intérêt, plus un pour le gène de référence, l&#39;intensification en fonction du nombre d&#39;échantillons. Préparez suffisamment de telle sorte que trois répétitions peuvent être préparés pour chaque échantillon, y compris un contrôle de modèle non (NTC) et échantillons de courbe standard, si la méthode de la courbe standard sera utilisé pour l&#39;analyse. </li><li> Pour chaque échantillon de fonctionner sur une plaque de 96 puits, mélanger le suivant: 5 pi de la 2X Solaris qPCR Master Mix, .5 pi de la version Solaris amorce / sonde set (20X), Et l&#39;eau de qualité PCR de telle sorte que le volume final de réaction, une fois l&#39;ADNc est ajoutée sera de 25 ul. Pour chaque échantillon de fonctionner sur une plaque de 384 puits mélanger la suivante: 12,5 ul de la 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 pl de la version Solaris amorce / sonde set (20X) et la PCR eau de qualité telle que le volume de réaction final, une fois l&#39;ADNc est ajoutée sera de 10 ul. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, transférer le mélange-maître dans les puits appropriés de la plaque. Le colorant bleu inclus dans le mélange maître faciliter le suivi des progrès de pipetage sur les plaques blanches. Ensuite, ajoutez le modèle de 1-5 ul d&#39;ADNc (pour une plaque de 96 puits) ou 1-2 pi de matrice d&#39;ADNc (pour une plaque 384 puits). Introduire à la pipette de haut en bas pour mélanger. Placer la plaque dans une centrifugeuse et centrifuger pour éliminer les bulles, car elles vont interférer avec les lectures de fluorescence. </li><li> Programmer le thermocycleur: L&#39;enzyme doit être activé avec un 95 ° C 15 min (1 cycle). Puis 40 cycles de 95 ° C, la dénaturation pendant 15 secondes, et unenealing et extension à 60 ° C pendant 60 secondes. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument qPCR. Démarrez le programme. </li></ol> Représentatifs des résultats de qPCR utilisant Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Dosages Solaris donner une détection fiable même à des concentrations très faibles d&#39;entrée, à en juger par l&#39;efficacité de la PCR et les valeurs de r2. Dix à 10 dilutions d&#39;ADNc synthétisés à partir de la séquence amplicon d&#39;ARN synthétique ou une séquence amplicon d&#39;ADN a été amplifié sur un instrument ABI 7900HT l&#39;utilisation de Solaris qPCR Gene Expression Assay pour F2RL1 ou Cdc20, respectivement. Les courbes d&#39;amplification log-échelle et des courbes standard sont représentées avec la performance de chaque test, y compris l&#39;efficacité, la valeur r2, la plage dynamique sur 10 log10 dilutions, et la limite inférieure de détection. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure2. Essais Solaris donner des résultats cohérents, même entre les différents chercheurs et des laboratoires. siRNA ciblant ALDOA et PPIB, ainsi que d&#39;un contrôle de non-ciblage (NTC), ont été transfectés dans des cellules HeLa à nM 100, 10, 1 et 0,1 concentrations finales. Les cellules ont été récoltées et l&#39;ARN total isolé 48 heures après le traitement. L&#39;ADNc a été synthétisé en utilisant Thermo Scientific Kit de synthèse d&#39;ADNc Verso. Une aliquote de l&#39;ADNc a été amplifié dans deux laboratoires géographiquement séparés à l&#39;aide de Solaris analyses qPCR l&#39;expression des gènes pour la détection de ALDOA, PPIB, et GAPDH sur LightCycler Roche 480 (384 puits) plate-forme. Knockdown a été calculé selon la méthode ΔΔCq (normalisée par rapport à la GAPDH gène de référence et NTC cellules traitées). Les mêmes niveaux de knockdown ont été démontrées pour les deux cibles génétiques entre les chercheurs des deux sites.

Les auteurs de cet article sont des employés de Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris analyses qPCR fournir une méthode simple et amélioré pour la réalisation d&#39;analyses qPCR. L&#39;utilisation d&#39;un algorithme de haute stringence, incorporant la technologie et MGB superbases, ces amorces et sonde fixe maximiser la fidélité et la robustesse des expériences de qPCR. Une amorce et un ensemble de sonde reconnaît tous les variants d&#39;épissage connus d&#39;un gène donné. Le site cible, chaque fois que possible, comprend les régions d&#39;exons couvrant, pour veiller à ce que l&#39;ADN génomique n&#39;est pas amplifié. Ces caractéristiques permettent d&#39;exécuter simultanément de nombreux échantillons, ce qui réduit considérablement la quantité de temps nécessaire pour effectuer des expériences complexes. Depuis le master mix est bleu, il est possible d&#39;utiliser des plaques opaques blanches, qui améliorent la sensibilité de la PCR quantitative, sans perdre de pipetage. Pris dans leur ensemble, les caractéristiques de conception de l&#39;essai qPCR Solaris faire de ce roman qPCR un test simple, mais de haute performance qui est à la fois spécifique et robuste.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / matériau </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Solaris APCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size) </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351/INT</a> </td><td> 100 x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351 / A</a> </td><td> 200 x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351 / B</a> </td><td> 400x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351 / C</a> </td><td> 1000 x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris analyses qPCR l&#39;expression des gènes </td><td> Thermo </td><td> AX-XXXXXX-XX-XXXX * </td><td> 100 rxns (1 x 125 pi) 200 rxns (2 x 125 pi) 400 rxns (4 x 125 pi) ou 1000 rxns (10 x 125 pi) </td></tr><tr><td> Kit de synthèse d&#39;ADNc Verso </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/product/productlandingtemplate.aspx?id=1177" target="_blank">AB-1453 / A</a> <a href="http://www.dharmacon.com/product/productlandingtemplate.aspx?id=1177" target="_blank">AB-1453 / B</a> </td><td> 40 x 20 uL rxns 100 x 20 uL rxns </td></tr><tr><td> ABgene plaque de 96 puits (jupe, P Bas<html> rofil, Blanc) ** </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2084" target="_blank">AB-0800 / W</a> </td><td> 25 plaques </td></tr><tr><td> ABgene Diamond Ultra 384-Eh bien PCR Plate, blanc ** </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2166" target="_blank">AB-2150 / W</a> </td><td> 25 plaques </td></tr><tr><td> Absolute qPCR adhésif Seal </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2008" target="_blank">AB-1170</a> </td><td> 50 feuilles </td></tr></tbody></table> * Numéro de catalogue spécifique du produit. S&#39;il vous plaît se référer à <a href="http://www.thermo.com/solaris" target="_blank">www.thermo.com / solaris</a> pour sélectionner le dosage approprié ** Pour les choix de compatibilité et de la couleur cycleur, consultez notre catalogue lates ou visitezmo.com / pcrplastics &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermo.com / pcrplastics

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Le test Solaris qPCR l&#39;expression des gènes est un nouveau type d&#39;amorce / sonde, conçue pour simplifier le processus de qPCR tout en conservant la sensibilité et la précision du dosage. Ces ensembles d&#39;amorces / sonde sont pré-conçue pour&gt; 98% des génomes de l&#39;homme et de la souris et améliorations de fonctionnalités importantes de technologies déjà disponibles. Ces améliorations ont été rendues possibles grâce à un algorithme de conception nouvelle, développée par des experts en bioinformatique Thermo Scientific. Plusieurs fonctionnalités pratiques ont été intégrées dans le test Solaris qPCR pour rationaliser le processus d&#39;exécution quantitative PCR en temps réel. Tout d&#39;abord, le protocole est similaire aux alternatives couramment employées, de sorte que les méthodes utilisées lors de qPCR sont susceptibles d&#39;être familiers. Deuxièmement, le mélange maître est bleu, ce qui rend l&#39;établissement des réactions qPCR plus facile à suivre. Troisièmement, les conditions de cyclage thermique sont les mêmes pour tous les tests (gènes), ce qui permet d&#39;exécuter de nombreux échantillons à moinsemps et en réduisant le risque d&#39;erreur. Enfin, la sonde et les informations séquence de l&#39;amorce sont prévus, ce qui simplifie le processus de publication. Ici, nous montrons comment obtenir des réactifs appropriés Solaris utilisant la fonctionnalité du produit GENEius recherche sur le site Web de commande (www.thermo.com / solaris) et comment utiliser les réactifs Solaris pour effectuer qPCR utilisant la méthode de la courbe standard.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Les analyses qPCR Solaris expression des gènes sont de nouveaux pré-conçus qPCR amorce / sonde combinaisons conçues pour simplifier le processus de qPCR sans pour autant sacrifier la spécificité et la robustesse de l&#39;analyse.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

49.6K vues.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Vidéo: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Recherche

Biologie

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Le génotypage des échantillons de plantes et d&#39;animaux sans purification d&#39;ADN Avant

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitative, en temps réel Analyse de l&#39;activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...