Les explants dérivés du patient sont une méthode à court terme fournissant des données de réponse immédiate au médicament qui peuvent prédire avec précision les résultats pour les patients. Les plates-formes permettent d’examiner les réponses des médicaments dans un contexte 3D qui reflète le plus fidèlement possible les caractéristiques pathologiques et architecturales des tumeurs régionales. Les explants ont le potentiel d’offrir de nouvelles perspectives sur le métabolisme et le mécanisme d’action d’un médicament et de faciliter l’identification de nouveaux biomarqueurs pharmacodynamiques.
Avant de commencer l’expérience, nettoyez tout l’équipement chirurgical avec une solution d’alcool méthylé industriel à 70%. Remplissez un plat de culture de 10 centimètres avec 25 millilitres de milieu frais sur glace. À l’aide d’une pince à épiler, transférez l’échantillon sur une surface de cire dentaire et utilisez deux lames de greffe de peau pour découper le tissu en fragments d’environ deux à trois millimètres cubes.
Transférer les explantations dans un plat de 10 centimètres et placer six à neuf morceaux de tissu dans un tube d’un millilitre contenant 10% de solution de formol non tamponnée pour une incubation de 24 heures à température ambiante. Remplissez le nombre de puits souhaité d’une plaque de six puits avec 1,5 millilitre de milieu frais par puits. Et placez un plat d’insertion de culture organotypique dans chaque puits afin qu’il flotte sur le milieu.
Placez six à neuf explants sur chaque disque d’insertion et stockez-les pendant 16 heures dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone pour permettre la récupération. Le lendemain, ajoutez du milieu frais et du médicament à chaque puits d’une nouvelle assiette. Inclure un puits pour le contrôle du véhicule.
Lorsque tous les traitements médicamenteux ont été préparés, utilisez une pince à épiler pour transférer un insert dans chaque puits de la nouvelle plaque de six puits pour une incubation de 24 à 48 heures dans l’incubateur à dioxyde de carbone. Après le traitement médicamenteux, transférer les disques dans six nouvelles plaques de puits contenant 10% de formol. Et ajoutez quelques gouttes de formol à 10% sur le dessus de chaque explante pour assurer une couverture complète avec le fixateur pendant 24 heures d’incubation à température ambiante.
Le lendemain, faire tremper un nombre approprié de petites éponges histologiques dans une solution méthylée industrielle à 70%. Et placez les éponges à l’intérieur de cassettes d’histologie. Lorsque toutes les éponges ont été placées, transférez toutes les explants de la même condition de traitement médicamenteux sur une seule éponge avec le côté traité par médicament de chaque explante en contact avec le disque inséré.
Placez une autre éponge pré-trempée sur le dessus de chaque explante et fermez la cassette pour fixer les explants dans la cassette. Ensuite, immergez les cassettes dans une solution méthylée industrielle à 70% avant de procéder au traitement histologique. Après la numérisation, effectuez une analyse de formation et chargez les numérisations contenant les tampons pour la formation dans le logiciel d’analyse approprié.
En mode unique, naviguez à travers les images et sélectionnez les scans à analyser et le scan avec fluorescence intrinsèque. avec le balayage de fluorescence intrinsèque sur une seule vue, cliquez sur le sélecteur d’autofluorescence pour dessiner un segment sur une zone de tissu non coloré. Cliquez sur Modifier les marqueurs et les couleurs et entrez les noms des marqueurs dans la zone associée à chaque fluorophore.
Cliquez sur Préparer les images pour permettre au logiciel de soustraire l’intensité de la fluorescence intrinsèque de toutes les images téléchargées. Cliquez sur l’étape segmenter le tissu en haut de l’écran pour ouvrir la fenêtre d’entraînement à la segmentation des tissus. Dans le panneau Catégories de tissus, entrez le nom de chaque catégorie de tissus à segmenter.
Cliquez sur Dessiner pour dessiner des régions autour de groupes de cellules dans la catégorie de tissus qui vous intéresse. Passez ensuite à la catégorie de tissus suivante et dessinez de nouvelles régions. Lorsque toutes les régions d’entraînement ont été définies, utilisez la segmenteuse de tissu de train et attendez que la précision de l’entraînement s’installe.
Peut-être à une valeur proche de 100%Cliquez sur le segment pour segmenter les tissus. Après avoir vérifié la qualité de la segmentation tissulaire, cliquez sur Segmentation cellulaire et sélectionnez les compartiments cellulaires à segmenter. Pour configurer le composant nucléaire, utilisez le curseur d’intensité standard pour ajuster le seuil utilisé pour détecter les pixels nucléaires.
Les commentaires en direct sont fournis par la fenêtre d’aperçu. Pour diviser les grappes de pixels nucléaires, dans le panneau de fractionnement des composants nucléaires, sélectionnez le bouton qui décrit le mieux la qualité de coloration des noyaux et utilisez la barre de défilement pour ajuster la sensibilité de fractionnement. Cliquez ensuite sur segmenter tout pour segmenter toutes les images.
Lorsque toutes les images ont été segmentées, dans le panneau Phénotypes, ajoutez la liste des phénotypes à détecter et entrez le nom des phénotypes dans la zone de texte correspondante. Cliquez sur Modifier les phénotypes pour sélectionner une cellule particulière et sélectionnez le phénotype correspondant dans le menu déroulant. Après avoir terminé la sélection pour la formation, cliquez sur le classificateur de train pour évaluer le résultat de chaque phénotype.
Continuez avec le phénotype tout, enregistrez le projet et cliquez sur exporter. Sélectionnez l’onglet Analyse par lots et chargez le projet dans l’algorithme de traitement par lots ou la zone de projet. Pour exporter les images et les tableaux, sélectionnez toutes les zones des options d’exportation, cliquez sur Ajouter des diapositives et chargez toutes les images contenant les tampons pour les lots préparés précédemment.
Cliquez ensuite sur Exécuter pour démarrer l’analyse par lots d’un tampon et exporter les données correspondantes lorsqu’elles ont été acquises. L’imagerie multispectrale du tissu explantaire du CPNPC coloré pour les marqueurs de la viabilité cellulaire permet l’identification et le phénotypage de populations cellulaires individuelles, ainsi que l’identification des composants tumoraux et stromaux dans le micro-environnement tumoral de l’explantation. La segmentation tissulaire et cellulaire des marqueurs de viabilité cellulaire colore des images multispectrales, comme démontré, peut être utilisée pour quantifier la mort et la prolifération cellulaires dans les explants dérivés de patients traités avec des médicaments d’intérêt.
Par exemple, dans cette analyse, dans des échantillons de tissus de tumeurs traitées par Nivolumab, un nombre plus élevé de cellules mourantes a été identifié par rapport aux échantillons de tumeurs traitées par le contrôle. De plus, comme illustré, la capacité d’extraire des informations spatiales à partir de dissections colorées permet le calcul des distances intercellulaires. Les explants peuvent également être utilisés pour un profilage spatial étendu ou une cytométrie de masse, ce qui permet de profiler simultanément des centaines de biomarqueurs à une résolution subsidiaire tout en préservant la structure 3D de l’échantillon.
Les pourraient prédire l’efficacité de l’immunothérapie. Par exemple, il pourrait être possible de distinguer les cas sensibles ou résistants aux inhibiteurs du point de contrôle immunitaire et d’étudier les mécanismes qui sous-tendent cette distinction.
