La recherche en laboratoire des auteurs est soutenu par le National Institutes of Health subventions R37-HL041026, R01 et R01-HL086483-HL056786 (SSS) et par F32-HL097463 et T32-AR048523 (PB) du Service des Etats-Unis santé publique.

1. Souris bord, socle musculaire, le coin le corps et la solution de surfusion <ol><li> Souris bord: Un rectangulaire transparente en plexiglas conseil d&#39;administration (6 &quot;de large X 8&quot; long X 3 / 16 &quot;d&#39;épaisseur) est fait pour tenir sur la scène du microscope L&#39;.&quot; Conseil de la souris &quot;est l&#39;endroit où la souris anesthésiée est garanti lors de la préparation chirurgicale des le muscle crémaster. </li><li> Piédestal musculaire: Un socle en caoutchouc transparent silastic est préparé à partir Sylgard 184, qui est mélangé selon les instructions du · Producteur s. Un moule commode est un 15 mm d&#39;épaisseur x 50 mm de diamètre de diamètre jetables boîte de Petri. Le bloc Sylgard est coupé à la forme souhaitée avec une lame de rasoir (voir figure 1C).. Une fine couche de colle silicone transparent imperméable est utilisé pour sécuriser le bloc Sylgard au conseil d&#39;administration de la souris. Conseils utiles: Après avoir versé le Sylgard dans la boîte de Pétri, de dégazage dans une chambre à vide pendant une heure, élimine les bulles d&#39;air et améliore la clarté. Après dégazage, le temps de durcissement pour les Sylgard est raccourcie en plaçant le plat dans un four de laboratoire à 50 ° C pendant plusieurs heures. </li><li> Wedge Corps et plate-forme de chauffage: Un coin (2 &quot;x 4&quot; x 15 °) placé sous la souris et contre le socle incline le corps vers l&#39;avant qui facilite l&#39;extension du muscle crémaster sur le socle de son origine. Intégrer une plateforme en aluminium sur la surface permet de chaleur par conduction. La plate-forme est chauffé par des résistances liées à une alimentation DC (figure 1A). Calibrage de la température de la plate-forme à ~ 40 ° C maintient la température de l&#39;œsophage à ~ 37 ° C. Sinon, la chaleur rayonnante d&#39;une lampe est utilisée. </li><li> Pins. Pour sécuriser le crémaster sur le piédestal, les broches sont préparés à partir de 0,15 mm broches insectes qui ont été pliées en &quot;L&quot;. </li><li> Solution salée physiologique (PSS). Les préparatifs sont perfusées (irrigué) en continu avec du bicarbonate tamponné PSS préparés ultrapure (18,2 MQ) H 2 O. Les solutions mères sont préparées à la concentration de travail finale 20X et stérilisée à travers un filtre de 0,2 um. Les solutions mères restent bonnes pendant plusieurs semaines s&#39;il est conservé à 4 ° C. Préparation des sels séparément du bicarbonate et de les mélanger avec la dilution sur le jour de l&#39;expérience empêche la précipitation du bicarbonate de calcium. La solution de sel d&#39;actions est composé de (en mmol / L): 2638 de NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. Le bicarbonate de stock est de 360 NaHCO 3. Le jour de l&#39;expérience, les solutions respectives sont portées à un volume final (typiquement 2 L pour une expérience donnée) dans une fiole jaugée et placé dans un bain d&#39;eau à ~ 37 ° C. Équilibrant le PSS avec 5% de CO 2 / 95% N 2 pour ~ 15 minutes à l&#39;aide d&#39;un disperseur de gaz ajuste le pH à 7,4 ~ et empêche la précipitation. Le PSS fait barboter en permanence avec 5% de CO 2 / 95% N 2 tout au long des expériences. La composition de la solution finale de travail (en mmol / L) est: 132 NaCl, KCl 4,7, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO3. </li></ol> 2. Anesthésie et préparation à la chirurgie <ol><li> Suite à l&#39;approbation de l&#39;Institutional Animal Care et du Comité utilisation, la souris mâle au moins 12 semaines sont utilisées. La souris est anesthésiés avec du pentobarbital sodique (60 mg / kg) par voie intrapéritonéale (IP) d&#39;injection. Un tube de retenue s&#39;avère utile pour la sécurisation de la souris lors de l&#39;injection initiale. Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, l&#39;anesthésie est maintenue par des suppléments (10-20% de l&#39;injection initiale, ip) comme il faut (toutes les 30-60 minutes; indiqué par réaction de retrait à l&#39;orteil ou de pincer la queue). Astuce: La dilution du pentobarbital 10 mg / ml dans une solution saline stérile avant l&#39;injection réduit la possibilité d&#39;un surdosage. </li><li> Anesthésie compromis régulation de la température afin de la souris doit être gardé au chaud immédiatement après la première injection. Placer la souris dans un support métallique (saladier en aluminium ventilé) sur le dessus d&#39;une plaque chauffante (calibré à ~ 37 ° C) fonctionne bien. Alternativement, une lampe de chaleur peut être utilisée en prenant soin de le positionner à une distance appropriée de la souris. La souris doit être surveillée toutes les 5-10 minutes jusqu&#39;à ce que le niveau approprié de l&#39;anesthésie est réalisée (manque de retrait à l&#39;orteil ou de pincer la queue). Une dose supplémentaire peut être nécessaire après 15-20 minutes. Il est préférable d&#39;être patient et procéder avec prudence pour éviter un surdosage, en particulier avec les animaux obèses ou âgés. </li><li> Le poil est retiré de l&#39;abdomen, le bas du dos, le scrotum et les jambes en prenant soin rasage régions respectives. Une attention particulière doit être prise pour éviter un traumatisme au scrotum et les testicules qui, autrement, blesser le muscle crémaster. Enlever les poils lâche avec une compresse imbibée d&#39;alcool frais. </li><li> Si la vessie est pleine il se sentira comme un petit raisin à travers la paroi abdominale. Vider la vessie en utilisant une pression douce pour éviter la souris d&#39;uriner sur la préparation crémaster pendant les expériences. Un Kimwipe est une éponge effet aux collectionst l&#39;urine. </li><li> Placez la souris sur le dos, couché sur le coin avec ses jambes à cheval sur le piédestal. Une suture de soie (4-0 ou 5-0) lié à chaque pied donne une attache pour fixer la souris avec son entrejambe contre le piédestal. Un morceau de ruban adhésif placé sur la poitrine vaguement et sécurisé au coin maintient la position générale du corps. Les interventions chirurgicales sont effectuées lors de la visualisation à travers une loupe binoculaire avec des ciseaux et des pinces à angle microdissection. </li></ol> 3. Préparation chirurgicale du muscle crémaster ouverte <ol><li> Une broche est placée par le sommet du sac scrotal (soit le côté droit ou gauche) et fixée dans le socle pour placer la tension sur la peau. Superfusion avec PSS (34-35 ° C) est lancé sur le champ opératoire et maintenues pendant toute la dissection de garder les tissus exposés au chaud et humide. Une mèche (fait à partir Kimwipe) placé à une extrémité à côté du scrotum et l&#39;autre à côté d&#39;une ligne sous vide enlève le PSS effluents. Un cordon de mastic silicone adhéré au Conseil de plexiglas et encerclant complètement le coin et socle sert de &quot;fossés&quot; pour collecter les PSS qui n&#39;est pas aspirée, servant une précaution efficace pour empêcher la fuite PSS sur le microscope. </li><li> Une incision est faite le long de la surface ventrale du sac scrotal. Si le testicule a été escamotée par le muscle crémaster dans la cavité abdominale, une légère pression sur le bas-ventre dirige le testicule dans le sac. La surface du muscle crémaster recouvrant le testicule doit être identifié à ce moment. Le tissu conjonctif entre la peau du scrotum et le muscle crémaster est soigneusement enlevé pour libérer le muscle crémaster du tissu environnant. </li><li> La peau du scrotum est légèrement rétracté derrière le bord proximal du piédestal et sécurisé de chaque côté avec une épingle. La surface extérieure de la surface du muscle crémaster est alors débarrassée des tissus conjonctifs. Surfusion continue pendant hydrates de dissection du tissu conjonctif, ce qui facilite la visibilité et l&#39;enlèvement. </li><li> Une épingle à travers l&#39;apex du crémaster est utilisé pour le placer sous tension longitudinale. Une incision longitudinale est faite à travers la surface ventrale du muscle avec grand soin pour minimiser la perturbation de la vascularisation. Dynamique de l&#39;écoulement de sang près de la périphérie de la préparation sont modifiés par la présente 14 dommages aux tissus. Par conséquent, pour minimiser ces effets sur la collecte de données, les vaisseaux sanguins à proximité du centre de la préparation sont utilisés pour l&#39;imagerie et des études physiologiques. </li><li> Le muscle crémaster est relié par un ligament mince pour l&#39;épididyme sous le testicule. Reflétant le testicule d&#39;un côté expose ce ligament, qui est soigneusement séparée de l&#39;épididyme. Près de la pointe du muscle crémaster est petite artère et une veine qui le relient à l&#39;épididyme. Occlusion de ces vaisseaux entre les forceps et les tirant minimise les saignements. Le testicule, épididyme, artère et veine testiculaire sont ligués proximale (4-0 ou 5-0 suture de soie), coupé et jeté (orchidectomie) avec le coussinet adipeux inguinale associée. Alternativement, le testicule peut être doucement repoussée dans la cavité abdominale et conservé avec un morceau de coton ou Kimwipe. L&#39;orchidectomie sert à éviter les traumatismes possibles au tissu en poussant les testicules dans la cavité abdominale. Nous n&#39;avons pas trouvé de différences notables dans la qualité de la préparation microcirculation crémaster (voir section 3.8) en utilisant soit la procédure 7,15. </li><li> La surface externe du muscle crémaster est effacé du tissu conjonctif reste et s&#39;est ensuite propagée radialement sur la surface du piédestal. Les bords sont sécurisés avec des épingles (voir section 1.4) en 5-6 endroits pour créer une feuille plane de muscle strié avec la microcirculation intacte. </li><li> La préparation terminée est transféré à la platine d&#39;un microscope intravitale, perfusées en continu (3-5 ml / min, 34 ° C) et équilibrée pendant 30 minutes. </li><li> Intégrité de la préparation crémaster est évaluée selon plusieurs critères. Vasomotricité spontanée avec un traumatisme chirurgical minimale est indiquée par un écoulement rapide dans les artérioles et le manque de leucocytes adhérents dans les veinules. L&#39;indice le plus sensible d&#39;une préparation de réactif est la constriction des artérioles à élever la teneur en oxygène surfusion solution pendant 5-10 minutes. Cela se fait par l&#39;équilibration avec 21% d&#39;O 2 (vs 5% d&#39;O 2, voir la section 1.5, tous avec 5% de CO 2, l&#39;équilibre de N 2). La présence de leucocytes dans les artérioles, l&#39;absence de globules rouges circulant dans les capillaires, et / ou les leucocytes s&#39;accumulent dans les veinules et des tissus environnants sont des signes de lésions tissulaires et l&#39;inflammation. </li></ol> 4. Imagerie intravitale de la microcirculation du muscle crémaster <ol><li> Intravitale imagerie est réalisée sur un microscope personnalisée basée sur une plate-forme Olympus MVX10 zoom stéréo. Le corps de microscope MVX10est monté sur un véhicule hybride MVX10 stand équipé avec transillumination (lampe halogène) pour fond clair (Köhler) d&#39;imagerie et d&#39;épi-illumination (lampe à mercure) pour l&#39;imagerie de fluorescence. L&#39;aide d&#39;Epi-illumination, GCaMP2 est excité à 472/30 nm avec une émission recueillies à 520/35 nm. Les images sont acquises à travers une lentille MT PLAPO 2XC (ouverture numérique = 0,50; Olympus) en utilisant une caméra numérique XR/Mega-10 intensifié (Stanford Photonics, Inc SPI) via logiciel de contrôle Piper (SPI) sur un ordinateur personnel. Avec ce système, le champ observé de vue (FOV) peut varier de 553 um X 442 um à 22 mm X 18 mm. </li><li> À la fin des expériences d&#39;imagerie intravitale, la souris anesthésiée est euthanasié à une surdose de pentobarbital suivie par dislocation cervicale. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Conseil d&#39;administration de la souris la figure 1. Pour l&#39;imagerie intravitale de la préparation de la souris crémaster. A) coin du corps avec la plate-forme en aluminium (isolé avec du plastique jaune) vu par le bas. Résistances de chauffage fixé à la face inférieure de la plate-forme de fournir de la chaleur menée. B) La plate-forme de chauffage repose sur une cale en plastique. C) Le coin corps est placé sur une planche de plexiglas pour la chirurgie et de son transfert ultérieur à l&#39;étape du microscope intravitale. Piédestal Sylgard est indiqué avec une flèche rouge. Un cordon de silicone étanche entoure toute la préparation pour contenir toute solution qui peut fuir pendant la procédure intravitale, l&#39;empêchant de couler sur le microscope. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Microscope à champ large Macrozoom personnalisé pour l&#39;imagerie. A) MVX10 corps du microscope (Olympus) avec la caméra ICCD XR/Mega-10 (Stanford Photonics) monté sur le port trinoculaire. B) Gros plan sur le corps du microscope. (A) le contrôle de zoom (0,63 à 6,3 x), (b) roue à filtres; l&#39;image (c) doubleur (NA = 0,50 avec un grossissement optique 25x). Condenseur de la C) pour fond clair (Köhler) éclairage (Condenseur NA = 0,55, distance de travail = 27 mm). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Terminé la souris crémaster préparation. La souris anesthésiés en décubitus dorsal sur la plateforme en aluminium recouvert de plastique chaud (jaune). La position du corps est sécurisé avec du ruban adhésif. Le muscle crémaster est réparti radialement sur le piédestal du caoutchouc silastic transparent et épinglé sur les bords. Solution de surfusion est introduit à l&#39;extrémité proximale par un goutteur en plastique (flèche blanche). Une ligne vide (tête de flèche blanche) élimine la solution via une mèche Kimwipe. Deux micropipettes sont montrés positionnés avec leurs conseils dans le tissu. Une électrode de référence (fil d&#39;argent) est fixé sur le bord inférieur du muscle crémaster. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Illustrant la plage de grossissement pour la visualisation des réseaux artériolaires exprimer GCaMP2 dans l&#39;endothélium. A) fluorescent et B) l&#39;image prise à fond clair grossissement optique 3,2 X de un grossissement total = 42X sur le moniteur vidéo. [Champ de vision (FOV) = 4375 x 3470 um]. Barre d&#39;échelle = 500 pm. Travailler à ce grossissement facilite le placement des micropipettes aux endroits voulus. C) fluorescent et D) l&#39;image prise à fond clair grossissement optique de 6.4X pour le grossissement total = 83X (FOV = 2200 x 1759 m). Barre d&#39;échelle = 200 pm. E) fluorescent et F) l&#39;image prise à fond clair grossissement optique de 12.6X pour grossissement total = 165X (FOV = 1100 x 885 um). Barre d&#39;échelle = 100 pm. G) avec doubleur de l&#39;image, grossissement optique = 25.2X. Barre d&#39;échelle = 50 microns.

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. 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Toutes les procédures et les protocoles impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation de l&#39;Université du Missouri et réalisée en accord avec le Guide National Institutes of Health pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. La production de ce vidéo-article a été parrainé par Stanford Photonics.

Nous décrivons ici la préparation musculaire ouverte crémaster chez la souris pour observer la microcirculation in vivo. Cette procédure est calquée sur la préparation crémaster &quot;ouverte&quot; décrit pour la première chez le rat 4. Avec la pratique toute la procédure chirurgicale peut être réalisée en moins de 1 heure. La polyvalence de cette préparation permet une variété de manipulations expérimentales et est facilement adaptable à des hamsters ainsi que les rats, ce qui permet une variété de modèles expérimentaux pour étudier de manière similaire. La préparation est limitée aux animaux mâles et les mesures doivent être faites en direction du centre du tissu, évitant les régions endommagée près des bords du muscle 14. Il faut aussi reconnaître que, tandis que les distributions de pression et de débit sont modifiés lorsque les navires d&#39;interconnexion du crémaster sont coupés 16, microvaisseaux rester réactif et adapté à la collecte des données reproductibles. La principale limitation à la visualisation de la microcirculation dans le muscle crémaster est l&#39;accumulation de tissu conjonctif comme les animaux matures et augmentation de la taille, en particulier chez les rats, mais aussi chez les hamsters. En outre, comme les animaux grossissent, plus il devient difficile de contrôler l&#39;anesthésie en raison du pentobarbital est lipophile et peut être absorbé dans le tissu adipeux. La meilleure façon de procéder est d&#39;être patient tout en veillant à ce que la température du corps des · s des animaux est maintenue à ~ 37 ° C tandis que le tissu exposé est irriguée en permanence par le PSS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif ou d&#39;un dispositif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Fisher </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de Potassium </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium </td><td> Fisher </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> De sodium en solution Nembutal </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> On parle aussi de pentobarbital sodique </td></tr><tr><td> Régulateur de température </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td> Autre: réglable alimentation 12V DC </td></tr><tr><td> Série 20 un kit de chauffage plateforme RH-2 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0274 </td><td> Nécessite plaque d&#39;aluminium sur mesure </td></tr><tr><td> Mega-10 Caméra </td><td> Stanford Photonics </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC lentilles </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 se hybrides </td><td> Leeds </td><td> LBX-hybride </td><td></td></tr><tr><td> Piper logiciel de contrôle </td><td> Stanford Photonics </td><td></td><td> Programme pour Mega-10 caméras </td></tr><tr><td> Microscope stéréo </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Mastic Silicone étanche (Clair) </td><td> General Electric </td><td> 47970-72643-LW5000 </td><td> Autres mastics silicones clair aussi le travail </td></tr><tr><td> 60 x 15mm boîte de Pétri </td><td> Fisher </td><td> 08 à 757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux Microdissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS Membrane </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Pins insectes Minutiens </td><td> Austerlitz </td><td> Taille M de 0,15 mm </td><td></td></tr><tr><td> Tondeuse Pet Compact </td><td> Clipper Wahl Corp </td><td> Modèle 9966 </td><td> Nettoyer après chaque utilisation </td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

Tout au long du corps, le maintien de l&#39;homéostasie nécessite l&#39;apport constant d&#39;oxygène et de nutriments concomitante avec élimination des sous-produits métaboliques. Cet équilibre est obtenu par le mouvement du sang dans la microcirculation, qui englobe la plus petite des branches de la vascularisation dans tous les tissus et les organes. Direction générale des artérioles des artères pour former des réseaux qui contrôlent la distribution et l&#39;ampleur de sang oxygéné se jeter dans la multitude de capillaires intimement associés à des cellules du parenchyme. Capillaires offrent une grande surface d&#39;échange entre les cellules par diffusion tissulaire et l&#39;approvisionnement en sang. Les veinules capillaires collecte des effluents et convergent, car ils renvoient le sang désoxygéné vers le cœur. Pour observer ces processus en temps réel nécessite une démarche expérimentale pour la visualisation et la manipulation de la microcirculation de vie. Le muscle crémaster de rats a d&#39;abord été utilisé comme modèle pour étudier l&#39;inflammation en utilisant l&#39;histologie et de microscopie électronique à 1,2 post mortem. Le premier dans le rapport in vivo du muscle crémaster exposés rat intact étudié les réactions aux médicaments vasoactifs microvasculaires utilisant la lumière réfléchie 3. Cependant la courbure du muscle et du manque d&#39;éclairage concentré limitée de l&#39;utilité de cette préparation. La percée majeure ouvrant entraîné le muscle, le détachant du testicule et de la propager radialement comme une feuille à plat pour la transillumination sous un microscope composé 4. Bien montré être une préparation précieuse pour étudier la physiologie de la microcirculation chez les rats et les hamsters 5 6, le crémaster chez la souris 7 s&#39;est révélée particulièrement utile à disséquer les voies cellulaires impliquées dans la régulation de la fonction microvasculaire 8-11 et imagerie en temps réel des intercellulaire de signalisation 12. Le muscle crémaster est dérivé de l&#39;abdomen muscles internes obliques et transversales comme les testicules descendent à travers le canal inguinal 13. Il sert de support (en grec: crémaster jarretelles =) et maintenir la température des testicules. Comme décrit ici, le crémaster est préparée comme une mince feuille plat pour une résolution optique exceptionnelle. Avec la souris maintenu à une température corporelle stable et plan de l&#39;anesthésie, la préparation chirurgicale implique de libérer le muscle du tissu environnant et les testicules, elle répand sur socle transparent de caoutchouc silastic et sécuriser les bords avec des épingles insectes alors qu&#39;il irriguer en permanence avec une solution salée physiologique . Le présent protocole utilise des souris transgéniques exprimant GCaMP2 dans les cellules endothéliales artériolaires. GCaMP2 est une fluorescentes codées génétiquement 12 molécules de calcium indicateur. Widefield d&#39;imagerie et d&#39;une caméra intensifiée dispositif de couplage de charge permettant l&#39;étude in vivo de la signalisation calcique dans l&#39;endothélium des artérioles.

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Une préparation tissulaire est décrit pour la visualisation et la manipulation expérimentale de la microcirculation de vie. Dans les souris mâles anesthésiés, les minces, très vascularisé crémaster muscle est préparé pour la microscopie intravitale pour étudier les réseaux microvasculaires, y compris les artérioles, capillaires et veinules. Cette préparation est facilement adaptable pour les rats et les hamsters.

La préparation de la souris crémaster pour l&#39;imagerie intravitale de la microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

32.1K vues.  University of Missouri. Une préparation tissulaire est décrit pour la visualisation et la manipulation expérimentale de la microcirculation de vie. Dans les souris mâles anesthésiés, les minces, très vascularisé crémaster muscle est préparé pour la microscopie intravitale pour étudier les réseaux microvasculaires, y compris les artérioles, capillaires et veinules. Cette préparation est facilement adaptable pour les rats et les hamsters.

Vidéo: The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophorèse et la micromanipulation pour l&#39;imagerie de fluorescence intravitale de la microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Recherche

Biologie

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l&#39;analyse des souches périphériques migration cellulaire

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualisation et quantification de la couche acellulaire en artérioles du muscle Cremaster Rat

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un protocole automatisé pour l&#39;analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Une méthode polyvalente pour le montage de Arabidopsis quitte pour l’imagerie Intravitale time-lapse

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test de chimiotaxie amélioré pour l’identification rapide des chimioattractifs rhizobactériens dans les exsudats racinaires

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...