L&#39;ensemble du protocole après l&#39;isolement cellulaire dure environ 2 heures. Une. Préparation de microchirurgie <ol><li> Effectuer l&#39;isolement de cellules souches de la moelle osseuse du donneur et un marquage fluorescent de la sous-population isolée selon des protocoles 9,12 permettre aux cellules de se reposer pendant le temps de l&#39;opération de l&#39;animal est effectuée normalisés. Pour le marquage fluorescent, nous recommandons CFDA (Carboxyfluorescein diacétate de succinimidylester). </li><li> Anesthésier une souris mâle pesant 20 à 25 g avec de la kétamine (75 mg / kg) et de xylazine (2,5 mg / kg). Tout au long des interventions chirurgicales et des protocoles expérimentaux, l&#39;anesthésie doit être maintenue par des suppléments (10% de l&#39;injection initiale, ip) au besoin (habituellement tous les 30-60 min). </li><li> Rasage en douceur la face antérieure du droit scrotum ainsi que la cuisse droite et à l&#39;aine. Recueillir tous les perdre les cheveux avec un coton-tige imbibé. Placez la face ventrale de la souris sur un stade plexiglas de visualisation et de fixer la taxet utilisant drap élastique. L&#39;étape est faite sur commande, constitué d&#39;une plaque de base et une seconde plaque au niveau du bord extrême de la plaque de base pour l&#39;élévation des deux jambes et le scrotum. Placez la scène sur un tapis de chauffage pour maintenir la température du corps à 37 ° C. Après fixation sur la scène, placer l&#39;animal sous un microscope d&#39;opération et effectuez les étapes de fonctionnement suivantes en utilisant 10 - 16 fois grossissement. </li><li> Faire l&#39;incision initiale à l&#39;aide de ciseaux de la peau à la cuisse droite, juste antérieure des vaisseaux fémoraux du genou jusqu&#39;à ce que de l&#39;aine. </li><li> Identifier l&#39;artère fémorale et suivre proximale, la mobilisation de l&#39;artère de tissus mous environnants. Identifier et couper une grosse branche au testicule gauche en utilisant thermocautère. Ensuite placez un séjour suture superficiellement au testicule gauche. Une traction douce facilitera davantage la mobilisation proximale de l&#39;artère fémorale. </li><li> Après l&#39;achèvement de la mobilisation proximale, d&#39;identifier et de couper une grosse branche courante medially à la cuisse par thermocautère. Ensuite ligaturer l&#39;artère fémorale dans la partie distale de la cuisse droite. Une légère traction sur la ligature aidera autre préparation. </li><li> Tournez attention maintenant à l&#39;artère fémorale proximale de nouveau et placer un fil de suture autour de l&#39;artère proximale que possible. Préparez un nœud, mais ne pas l&#39;attacher vers le bas encore. Appliquer une légère traction sur la suture et créer un vrillage artérielle. </li><li> Après avoir établi le vrillage, inciser l&#39;artère utilise avec soin un microscissor. Faites attention à ne pas endommager la veine fémorale. </li><li> Insérez un microcathéter préparée (diamètre intérieur de 0,28 mm) par l&#39;incision. Le cathéter doit être désaéré (chlorure de sodium à 0,9%, NaCl) et relié à une insertion préalable de la seringue de 1 ml. </li><li> Après l&#39;insertion du cathéter de succès, desserrer soigneusement le vrillage afin de faciliter le passage du cathéter. Le flux sanguin artériel doit être immédiatement visible dans le cathéter. Avancer doucement le cathéter quelques millimètress au-delà de la pliure précédente. Par la suite, attacher la ligature préparé pour la fixation du cathéter. </li><li> Rincez délicatement le cathéter (NaCl 0,9%) et aspirer à confirmer la bonne position. Utilisez un morceau de ruban adhésif pour fixer davantage le cathéter à la phase d&#39;exploitation. </li><li> Après fixation adéquate, mettre le cathéter de côté pour les étapes suivantes de préparation de la crémaster. Appliquer le rinçage régulier et l&#39;aspiration du cathéter chaque 5-10 min afin d&#39;empêcher la formation de caillots. </li><li> Tournez attention maintenant à la droite du scrotum et faire une incision en coupant la peau et le fascia-dessus de la face ventrale du droit scrotum. Prenez soin de ne pas toucher le tissu sous-jacent avec tous les instruments. </li><li> Étendre l&#39;incision jusqu&#39;à pli inguinal et caudale à l&#39;extrémité distale du scrotum. </li><li> Tissu soigneusement séparée sous-jacent doux et conjonctif au-dessus du sac crémaster, sans le toucher. Identifier l&#39;extrémité distale du crémaster, et placer un séjour suture ici pour slétendre ightly le muscle. Réséquer maintenant restant tissus mous sous le sac de muscle en tirant doucement le muscle en bas et en avant. </li><li> Après la séparation complète du tissu conjonctif, ouvrir le sac crémaster à un point sur le bord du crâne avec des ciseaux. Étendre l&#39;incision vers le bas à partir de cette ouverture à l&#39;extrémité distale du muscle. </li><li> Sceller le petit bateau reliant le testicule et le crémaster utilisant thermocautère, puis couper les connexions restantes entre le muscle et le testicule avec des ciseaux. </li><li> Mettons de côté le testicule, sur le domaine de la microscopie. </li><li> Le crémaster ouvert établit maintenant à plat sur la scène. Placez quatre 6-0 Prolene séjour sutures sur les bords du tissu et les fixer avec drapé élastique afin de répartir le tissu cremaster musculaire. A partir de maintenant humidifier le tissu en continu avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une seringue de 1 ml (Figure 1). </li><li> Autoriser maintenant la préparation se reposer pendant 15 min. Injecter la suiteDe 0,05 à 0,1 ml de 1% de rhodamine-dextran par l&#39;intermédiaire de l&#39;artère fémorale gauche pour l&#39;amélioration du contraste du système microvasculaire. Si des chimiokines ou inflammatoires sont prévues pour l&#39;application, vous devriez maintenant topique humidifier le muscle avec le réactif respectif en utilisant une seringue de 1 ml. Dans le cas d&#39;une expérience de contrôle, poursuivre l&#39;humidification avec de la PBS. </li></ol> 2. Microscopie intravitale <ol><li> Gardez la souris fixé sur la phase d&#39;exploitation et de passer sous un microscope à fluorescence modifiée pour épi-illumination et relié à un capteur CCD (dispositif à couplage de charge) caméra vidéo. Prenez soin de ne pas disloquer le cathéter dans l&#39;artère fémorale. </li><li> Mener des expériences en utilisant un objectif à immersion d&#39;eau. </li><li> Après réglage de l&#39;objectif pour la visualisation suffisante de la microcirculation crémaster et avant l&#39;injection des cellules, de définir de manière stochastique six veinules post-capillaires pour une analyse ultérieure de l&#39;adhérence ferme sur les cellules souches. </li><li> Administrer les cellules souches marqués par fluorescence,dissous dans 200 ul de PBS, à 0,4 x 10 6 cellules par injection, avec un total de cinq injections consécutives en utilisant le cathéter de l&#39;artère fémorale et une seringue de 1 ml. Secouez l&#39;échantillon de cellules avant la première injection. </li><li> les cellules souches de la fiche de laminage immédiatement après l&#39;injection des cellules, de manière à définir &quot;rouler&quot; comme une réduction de plus de 50% de la vitesse de cellule le long de la paroi endothéliale en combinaison avec cellulaire typique &quot;stick and release&quot; mouvements. Effectuer le comptage des cellules souches de roulement et toutes les cellules souches passant une distance de veinules prédéfinie pendant 1 min d&#39;observation après chaque injection. La quantité de laminage de cellules souches est exprimée en pourcentage de toutes les cellules qui passent. Ne pas compter les cellules présentant de brefs phénomènes d&#39;attache aléatoires que les cellules de roulement. </li><li> Après la dernière injection de cellules de déterminer le nombre de cellules souches adhérentes en comptant fermement et exprimer la quantité par rapport à la surface de l&#39;endothélium calculé èmee six veinules prédéfinis (diamètre x longueur x π) comme cellules adhérentes / mm 2. L&#39;adhérence est considérée comme ferme lorsque aucun mouvement de la cellule est détectable pendant 30 sec. </li><li> Après l&#39;achèvement de la microscopie intravitale retirer délicatement le muscle crémaster et le stocker dans la correspondance à une analyse ultérieure (immunohistochimie ou biologie moléculaire). Sacrifier l&#39;animal par dislocation cervicale. L&#39;analyse des enregistrements de microscopie intravitale pour la quantification de la tige de laminage et l&#39;adhésion cellulaire endothéliale ferme, ainsi que les paramètres hémodynamiques microvasculaires, telles que la vitesse du sang rouge des cellules (mm / sec), la longueur du navire (um), cuve diamètre (um), la vitesse de l&#39;action de paroi (sec -1); doit être effectuée en ligne par un enquêteur aveugle pour le traitement de tissu expérimental respectif en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image. </li></ol>

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

Tous les expérimentations animales, réalisées pour ce manuscrit ont été approuvés par le comité de protection des animaux et l&#39;utilisation locale. Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

<html> La microscopie à fluorescence intravitale permet la visualisation directe et une analyse quantitative des interactions cellules-souches endothéliales. Le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile, étant donné que l&#39;exposition et les techniques de microchirurgie visualisation intravitale ont été bien établies au cours de la recherche sur les interactions des leucocytes et l&#39;endothélium différents composants chimiques peuvent être appliqués de façon sélective à du tissu cible par...

Le but du présent article est de décrire la technique de microscopie intravitale (IVM) appliqué sur le crémaster microcirculation de la souris pour l&#39;observation directe et l&#39;analyse de la migration de la moelle osseuse de cellules souches périphériques. Tissus et organes régénération, le concept actuel de cellules souches basée implique la domiciliation des cellules souches dérivées de la moelle osseuse dans le tissu lésé 1. Une étape cruciale pour la réussite de la migration de cellules souches comprend des cellules souches interaction avec l&#39;endothélium locale au sein de l&#39;organe lésé suivie par la migration trans-endothéliale et, éventuellement, la prise de greffe organe 2. Intravitale analyse de ces cellules souches - interactions des cellules endothéliales forme un paramètre idéal pour la quantification d&#39;une réponse par récupération à base de cellules souches dans des contextes différents physiopathologiques in vivo. En outre, il semble concevable que, dans l&#39;avenir, l&#39;analyse intravitale de la capacité migratoire des cellules souches spécifiques populations dans les environnements de la microcirculation normalisés, pourraient être appliquées avant la promotion de ces populations à d&#39;autres essais cliniques. Microscopie intravitale a été initialement mis au point pour l&#39;observation et la quantification de l&#39;interaction de la cellule leucocyte-endothéliale in vivo dans le domaine de la recherche inflammatoire 3. Premiers enregistrements succès des études de microscopie intravitale ont été signalés par Cohnheim déjà au 19ème siècle, l&#39;étude des langues et mésentères de grenouilles sous un microscope optique 4. Depuis sa première utilisation IVM a connu un développement technique énorme et aujourd&#39;hui certains éléments essentiels constituent les conditions préalables pour effectuer IVM quantitative: (i) des préparations de tissus qui permettent l&#39;accès optique, (ii) des sondes moléculaires qui peuvent être détectés par un microscope, (iii ) un microscope raccordé à un système de détection et (iv) sur la base de l&#39;analyse des systèmes informatiques qui peuvent extraire des paramètres d&#39;intérêt à partir des données d&#39;imageset 4. Une variété de préparations de tissus a été introduit pour les études IVM y compris les mésentère et le foie de la souris et le rat 5, les chambres dorsale du pli cutané de la souris et le hamster 6, l&#39;oreille de lapin et le hamster cheek pouch pour n&#39;en nommer que quelques-uns. Toutefois, dans ce qui suit, nous allons nous concentrer sur le crémaster muscle de souris, ce qui représente un tissu idéal pour les observations intravitale, la préparation et la visualisation sont possibles par une intervention chirurgicale bien standardisée, et en général pas de problèmes d&#39;artefacts de mouvement se produire. La préparation crémaster muscle ouverte a été réalisée pour la première fois dans les années 1970 par Baez et ses collègues 7. Initialement décrit chez le rat, il a été adopté avec succès également pour la souris 8. Après des études antérieures avaient principalement porté sur les interactions des leucocytes avec la paroi du vaisseau, notre groupe a récemment introduit la souris crémaster préparation musculaire comme évable outil pour la visualisation directe et l&#39;analyse quantitative des interactions cellule-souches endothéliales dans un microenvironnement défini 9. Différentes sous-populations de cellules souches a été étudiée en utilisant ce modèle, y compris murin c-kit + de la moelle osseuse les cellules souches et les cellules souches mésenchymateuses, ainsi que les CD humaines des cellules souches 133 + de la moelle osseuse de 10 à 12. Suite à l&#39;isolation de cellules de moelle osseuse du donneur et un marquage fluorescent pour la visualisation, les cellules souches sont appliqués de manière sélective dans la microcirculation crémaster utilisant une injection artérielle par l&#39;intermédiaire de l&#39;artère fémorale, ce qui évite tout coincement des cellules dans des organes distants. En outre, le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile car diverses chimiokines potentiellement médiatrices migration de cellules souches locales dans les paramètres respectifs, peuvent être appliquées par voie topique au tissu cible par une technique de surfusion simple.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

À l&#39;ère de protocoles d&#39;application intravasculaire de cellules dans le cadre de la thérapie cellulaire régénérative, les mécanismes sous-jacents de la migration des cellules souches de tissu nonmarrow n&#39;ont pas été complètement clarifiée. Nous décrivons ici la technique de microscopie intravitale appliquée à la cremaster microcirculation de la souris pour l&#39;analyse de la moelle osseuse migration périphérique de cellules souches in vivo. Microscopie intravitale de l&#39;M. crémaster a été préalablement introduit dans le domaine de la recherche inflammatoire pour l&#39;observation directe de l&#39;interaction des leucocytes à l&#39;endothélium vasculaire. Depuis souches périphériques suffisante et la migration des cellules progénitrices comprend les étapes initiales similaires de rouler le long et ferme adhésion à la endothéliales tapissant il est envisageable d&#39;appliquer le modèle de cremaster M. pour l&#39;observation et la quantification de l&#39;interaction des cellules intravasculary souches administrées avec l&#39;endothélium. Comme différents composants chimiques peuvent être appliqués de manière sélective à la cible tquestion par des techniques de surfusion simples, il est possible d&#39;établir des conditions préalables essentielles du micro-environnement, pour le recrutement de cellules souches initiale aura lieu dans un organisme vivant à l&#39;extérieur de la moelle osseuse.

En général, l&#39;interaction d&#39;injecter directement des cellules souches ou progénitrices avec l&#39;endothélium vasculaire au sein de la microcirculation du muscle crémaster est un événement rare et se produit exclusivement dans veinules post-capillaires (diamètre: 30 à 80 um). En raison de la fluorescence étiquetage laminage et les cellules souches fermement adhérentes peuvent être clairement quantifiés dans la séparation de leucocytes circulants endogènes dans les veinules observés (Figur...

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Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Microscopie intravitale de la microcirculation souris crémaster M. offre un service unique et bien normalisé modèle in vivo pour l&#39;analyse de la moelle osseuse migration de cellules souches périphériques.

Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l&#39;analyse des souches périphériques migration cellulaire

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K vues.  University Rostock.  Microscopie intravitale de la microcirculation souris crémaster M. offre un service unique et bien normalisé modèle in vivo pour l'analyse de la moelle osseuse migration de cellules souches périphériques. 

Vidéo: Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

La préparation de la souris crémaster pour l&#39;imagerie intravitale de la microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Recherche

Biologie

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophorèse et la micromanipulation pour l&#39;imagerie de fluorescence intravitale de la microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l&#39;analyse de l&#39;ARN-séquençage

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualisation et quantification de la couche acellulaire en artérioles du muscle Cremaster Rat

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analyse du Gap Junction-dependent Transfert de miARN avec microscopie 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopie subcellulaire intravitale de la glande mammaire

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Microscopie subcellulaire intravitale de la glande mammaire

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

Imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome envahissant le cerveau du poisson zèbre

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...