<p class="jove_content"&gt; Nous remercions JJ Zhang de discussion perspicace et généreusement fournissant des réactifs. MJ est soutenu par le NIH Grant cardiovasculaires formation, le Fonds en Arizona Technology Initiative de recherche, et récompense les accomplissements scientifiques pour le collège. Ce travail est soutenu par le Prix du directeur des NIH Innovateur Nouvelle (1DP2OD007161-01), la National Science Foundation (0.855.890) et le James S. McDonnell.</p

1. Création de moules utilisés pour la modélisation <ol><li> Conception des modèles. Les modèles sont créés qui servent à former des réseaux cellulaires, contacter la cellule de contrôle, d&#39;isoler les cellules, imitent les structures naturelles, ou autrement Guide d&#39;adhésion cellulaire et de placement. </li><li> Computer-aided design ou la création de CAO basée sur modèle et création de photomasque. Le motif désiré est conçu dans les logiciels de CAO, comme AutoCAD, et est ensuite envoyé à une entreprise extérieure pour la production d&#39;un photomasque. </li><li> Photolithographie tendance à produire maître. Lames de verre sont modelés soit positif minces résister ou un négatif d&#39;épaisseur résistent en fonction de la taille de la structure ainsi créée. Lames de verre sont utilisées pour leurs avantages d&#39;être à faible coût, plus fort que des plaquettes de silicium et de ne pas produire autant de poussière lorsqu&#39;elles sont brisées. Alternativement, d&#39;autres structures pratiques telles que des réseaux de diffraction peut être utilisé comme le modèle maître. </li><li> La diapositive motifs est attaché à une pile de diapositives qui n&#39;ont pas été à motifs. Toutes les étapes sont effectuées dans une hotte à flux propre pour minimiser la poussière. </li><li> Création de moules maître. Un conteneur d&#39;un peu plus grand que la pile de papier d&#39;aluminium diapositives est créé pour contenir les 30 g de polydiméthylsiloxane (PDMS), qui est ensuite versé sur la surface photolithographie motifs pour créer un moule initial. Le PDMS est dégazé et laissé à durcir pendant un à deux jours. </li><li> Une fois durci le PDMS est décollé du modèle maître et forme un moule pour la prochaine étape. </li><li> 6 g de 2 époxy partie (# 14310 Devcon (6 g) est mélangé pendant 1 minute et ensuite versé dans le moule maître, dégazé et a permis de guérir. Dégazage l&#39;époxy doit être fait rapidement (&lt;8 min) à l&#39;aide de bulles de nombreuses briser les cycles et en utilisant seulement une fine couche avant de l&#39;époxy durcit et l&#39;enlèvement bulle devient impossible d&#39;enlever les bulles. Le 6 g utilisé produit une couche mince qui facilite l&#39;élimination de bulles rapide. </li><li> Après une heure, l&#39;époxy partie 2 sera partiellement guéri et plus époxy peut être ajoutée sur le dessus sans dégazage pour produire une structure plus épaisse qui est Easer à manipuler dans les étapes ultérieures. La résine époxyde est ensuite laissé à durcir pendant un à deux jours. </li><li> Une fois guéri, l&#39;époxy est retiré du moule maître PDMS et la bande est enroulée autour du moule époxy pour former un conteneur. Un moule de travail est alors créé en versant PDMS sur le moule d&#39;époxy, le dégazage du PDMS, et la cure d&#39;un à deux jours. </li><li> Une fois durci, le moule de travail est décollée de l&#39;époxy et stockés pour maintenir la propreté. </li></ol> 2. Modélisation de surfaces avec des moules pour l&#39;orientation des cellules <ol><li> Petites sections du moule de travail sont découpés et placés sur une boîte de Pétri en polystyrène. Les emplacements de ces sections de moules sont étiquetés. </li><li> Un trépied est formé à partir des petites sections et pondérées pour assurer le contact entre le moule de conformation de travail et de la surface boîte de Pétri. Bon placement peut être observé en regardant le fond du plat. </li><li> L&#39;ensemble est placé dans la chambre à plasma. Le traitement plasma est initié et poursuivi à 150 Pa à 29,6 W (puissance maxi) pendant 10 minutes à l&#39;aide de plasma d&#39;air. </li><li> Après un traitement au plasma, le moule et mise en accusation de poids sont enlevés. </li><li> La boîte de Pétri est placé sous la lumière UV pour 10 minutes de stérilisation à l&#39;intérieur du cabinet de biosécurité et qui y sont stockées jusqu&#39;à ce ensemencées avec des cellules. </li></ol> 3. L&#39;ensemencement des surfaces avec des cellules <ol><li> Cellules SH-SY5Y CRL-2266 neuroblastome humain ou d&#39;autres sont cultivées en utilisant des protocoles standard pour le type de cellule. </li><li> Le confluent de la SH-SY5Y CRL-2266 cellules de neuroblastome humain est mesuré visuellement avant l&#39;ensemencement sur la surface à motifs. </li><li> Fractionnement cellulaire standard est effectué pour éliminer les cellules de la surface de leur boîte de Pétri. </li><li> Les cellules, flottant une fois libres, sont ensemencées sur la surface du plat à motifs de Petri après avoir été dilué pour atteindre la confluence désiré lorsqu&#39;il est placé sur la surface à motifs. </li><li> Les cellules sont autorisés à s&#39;établir et à fixer à la surface. </li><li> Le plat à motifs de Pétri est incubée pendant plusieurs heures à plusieurs jours tandis que les cellules montons sur le motif créé par le plasma. </li><li> Lorsque la culture de cellules de neuroblastome l&#39;, l&#39;acide rétinoïque (10 M) est ajouté quotidiennement afin d&#39;induire les cellules à se différencier en un état neurone-like. L&#39;addition de l&#39;acide rétinoïque est fait dans l&#39;obscurité. </li><li> L&#39;acide rétinoïque est ajouté quotidiennement pendant plusieurs jours, après laquelle la différenciation sera observable. </li><li> Media est remplacé tous les 3-4 jours. </li></ol> 4. L&#39;observation et l&#39;analyse <ol><li> Images périodique des cellules vivantes ou des vidéos sont prises afin d&#39;observer le comportement des cellules au cours du temps. Pour les images en direct, les cellules sont placées dans une platine de microscope dessus incubateur qui maintient les cellules à 37 ° C CO, 100% d&#39;humidité, et 5% 2. Les cellules peuvent également être fixés et colorés pour l&#39;observation en fluorescence </li><li&gt; Les images ou les vidéos des cellules qui ont été capturés sont importées à un système d&#39;analyse d&#39;image et mesures sont effectuées, y compris le taux de croissance, la taille des cellules, la vitesse de migration, la différenciation, l&#39;alignement, la localisation des protéines spécifiques, et d&#39;autres. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un résultat typique d&#39;application de la technique de lithographie plasma est la formation d&#39;un modèle de cellules qui ressemble à une certaine structure arbitraire ou naturel. Cela se voit dans la figure 1a-b où lignes et réseaux de neurones ont été créés. D&#39;autres types cellulaires peuvent être utilisés ainsi que le montre la figure 1c-d, ce qui montre l&#39;homme des cellules endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) et les cellules musculaires squelettiques C2C12 formant des grilles. Des matériaux tels que le poly-L-lysine peut aussi être modelée, figure 1E pour faciliter la fixation de certains types cellulaires et pour autres usages. Dans le cas des neurones montré, ce qui a été créé des réseaux de cellules qui ont des connexions entre eux. Cela reproduit ce qui se passe naturellement dans le cerveau où les neurones ont des liens discrets entre cellules voisines qui influe sur le fonctionnement du cerveau. Avec la création d&#39;une telle structure dans le laboratoire, le nombre, la position, la fréquence et d&#39;autres facteurs de connexions peuvent être systématiquement contrôlés. Le résultat de ces mises en accusation peut être mesurée visuellement et entrées supplémentaires, tels que produits chimiques ou la stimulation électrique peut être mis en œuvre pour sonder le comportement du réseau. Un résultat négatif serait un motif de envahis ou incomplètes, ou un échantillon contaminé. Un motif incomplet ou envahies résulterait de l&#39;ensemencement du substrat avec soit des cellules trop peu ou trop nombreuses, qui ne fournirait pas le motif avec une quantité idéale de cellules. De plus, si le modèle n&#39;est pas conçu correctement (par exemple, les lignes trop étroites), les cellules ne sera pas en mesure d&#39;attacher et de se développer avec succès sur elle. Dans le cas d&#39;un échantillon contaminé, la propreté correcte n&#39;aurait pas été maintenu pendant une des étapes si cela est rare quand on suit le protocole de culture cellulaire appropriée en raison du fait que la structuration du plasma stérilise aussi le substrat. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Modélisation des cellules et des protéines.

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	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-treated+polystyrene+surfaces:+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions.">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li><li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Sch&#246;n, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion.">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li></ol>

La méthode d&#39;investigation de cellule présentée ici permet de créer des motifs complexes de réseaux multicellulaires qui imitent les structures biologiques aussi bien que fournit une méthode pour produire des stimuli qui sont subcellulaire dans la nature qui facilite ensuite les enquêtes sur le comportement des cellules à la fois groupés et les réponses des cellules simples à des facteurs environnementaux. L&#39;utilisation de cette méthode est simple mais robuste car il peut être rapidement réalisée avec du matériel à faible coût dans le même laboratoire que la culture cellulaire. Il est également fortement cellulaires sensibles, permet d&#39;observer facilement le comportement et la résultante est par nature stable pour de longues périodes, ce qui permet l&#39;étude du comportement des cellules à long terme. Il permet en outre d&#39;une gamme diverse d&#39;expériences à réaliser car il est compatible avec de nombreux types cellulaires et peuvent créer des motifs arbitraires. La stabilité à long terme de la technique provient du fait que la fonctionnalisation de surface transmise par le plasma fait partie de la surface et n&#39;est pas un enduit ou autre couche qui peut être enlevé ou dégradés. S&#39;il est gardé sous liquide, ce type de modification peut conserver sa capacité de cellules directeurs des mois. La partie la plus critique de l&#39;expérience nécessaires pour garantir des résultats significatifs est celui de créer le schéma directeur qui sera finalement utilisé pour le guidage cellulaire. Si cette tendance n&#39;est pas bien conçu, les cellules ne sera pas appropriée de répondre aux tendances et ne peuvent pas produire un comportement utile. Des paramètres tels que la largeur de ligne, l&#39;espacement modèle, et d&#39;autres peuvent influencer grandement la compatibilité des cellules avec un modèle particulier, et généralement toute une série de paramètres peuvent être créés sur le photomasque initiale à l&#39;écran pour la conception la plus appropriée. D&#39;autres paramètres importants liés à la réalisation de motifs comprennent la création du moule, le maintien d&#39;un environnement sans poussière, l&#39;ensemencement de cellules et de la stérilité générale de la culture cellulaire. Création de la moisissure peut être effectuée par les étapes de transfert différentes, qui sont entrepris pour permettre répétées PDMS de larguer les amarres un moule epoxy. Le moule epoxy est créé, car il ne se dégrade pas de la même manière comme une résister à la moisissure avec de petites structures de haute ratio d&#39;aspect sous casting répétée. Si le moulage par transfert est fait correctement, les dimensions et le rendement ne sera pas affecté, mais si mal fait par exemple en mal de dégazage, séchage incomplet, ou chauffage excessif, les bulles, la rugosité et la déformation d&#39;un modèle peut se produire qui affecte le résultat final. En ce qui concerne le maintien d&#39;un environnement sans poussière, les moules doivent être aussi propres que possible, car toute la poussière peuvent interférer avec le bon contact entre le moule travailler PDMS et la surface du plasma et donc bon blindage et la structuration des produits chimiques. La densité d&#39;ensemencement de cellules doit également être optimisés afin d&#39;assurer que ni trop peu de cellules ou d&#39;un trop grand nombre habitent la région modèle et la stérilité doit être maintenue pour éviter la contamination bactérienne et d&#39;autres des cellules utilisées. La technique peut aussi être incorporés à d&#39;autres éléments comme la microfluidique, des microélectrodes, et des sondes mécaniques. Cela fournit des stimuli additionnels pour les cellules afin de mieux reproduire les différentes conditions physiologiques lors de l&#39;expérimentation et les travaux futurs se concentre sur l&#39;étude des effets de ces combinaisons

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Nettoyeur Plasma et chambre à vide </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescence et microscope inversé à contraste de phase </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Microscope étage supérieur incubateur </td><td> AmScope </td><td> Modèle TCS-100 </td><td> Mise à jour pour inclure une enceinte qui fournit une atmosphère appropriée </td></tr><tr><td> Polystyrène boîte de Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polydiméthylsiloxane (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epoxy </td><td> Devcon </td><td> 2 tonnes époxy clair # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Milieux de culture cellulaire </td><td> Divers </td><td></td><td> Médias suit formulations standard pour le type de cellule </td></tr><tr><td> L&#39;acide rétinoïque </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

Manipulation systématique d&#39;un microenvironnement cellulaire avec une résolution de micro-et nano est souvent nécessaire pour déchiffrer les différents phénomènes cellulaires et moléculaires. Pour répondre à cette exigence, nous avons développé une technique de lithographie plasma pour manipuler le microenvironnement cellulaire en créant une surface texturée avec des tailles allant de fonction de 100 nm à quelques millimètres. Le but de cette technique est d&#39;être capable d&#39;étudier, de façon contrôlée, les comportements des cellules individuelles ainsi que des groupes de cellules et de leurs interactions. Ce procédé de lithographie de plasma est basé sur la modification sélective de la chimie de surface sur un substrat au moyen d&#39;un blindage au contact de basse température du plasma avec un moule physique. Ce blindage sélective laisse un modèle chimique, qui peut guider la fixation des cellules et le mouvement. Ce modèle, ou un modèle de surface, peut ensuite être utilisé pour créer des réseaux de cellules dont la structure peut imiter que l&#39;on trouve dans la nature et produit un environnement contrôlable pour des recherches expérimentales. La technique est bien adaptée à l&#39;étude de phénomènes biologiques car elle produit les modèles de surface stable sur des substrats polymères transparents de manière biocompatible. Les motifs de surface pour la dernière semaine à plusieurs mois et peut ainsi guider l&#39;interaction avec les cellules pendant de longues périodes ce qui facilite l&#39;étude de long terme des processus cellulaires, tels que la différenciation et l&#39;adaptation. La modification de la surface est essentiellement de nature chimique et n&#39;a donc pas d&#39;introduire des interférences topographiques ou physiques pour l&#39;interprétation des résultats. Elle ne comporte pas toutes les substances dures ou toxiques pour atteindre la structuration et est compatible pour la culture de tissus. Par ailleurs, il peut être appliqué à modifier différents types de substrats polymères, ce qui fait de la capacité d&#39;ajuster leurs propriétés sont idéales pour et sont largement utilisés dans des applications biologiques. La résolution atteinte est également bénéfique, comme l&#39;isolation des processus spécifiques comme la migration, l&#39;adhésion, ou de liaison permet d&#39;discrets, des observations claires à la seule au niveau multicellulaire. Cette méthode a été employée pour former des réseaux divers de différents types de cellules pour les enquêtes impliquant la migration, la signalisation, la formation des tissus, et le comportement et les interactions des neurones mis en accusation dans un réseau.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Une technique de plasma polyvalent lithographie a été développé pour générer des modèles de surface stable pour orienter l&#39;attachement cellulaire. Cette technique peut être appliquée pour créer des réseaux cellulaires, y compris ceux qui imitent les tissus naturels et a été utilisé pour étudier plusieurs types cellulaires distincts.

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K vues.  University of Arizona. Une technique de plasma polyvalent lithographie a été développé pour générer des modèles de surface stable pour orienter l'attachement cellulaire. Cette technique peut être appliquée pour créer des réseaux cellulaires, y compris ceux qui imitent les tissus naturels et a été utilisé pour étudier plusieurs types cellulaires distincts.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&amp;#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Un système microfluidique avec Patterning de surface pour les enquêtes cavitation Bubble (s) Interaction -Cell et les effets biologiques résultantes au niveau d&#39;une seule cellule

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data sets of patient or specimen anatomy in clinical or preclinical settings. However, the use of a virtual, on-screen display limits the ability of these tomographic images to fully convey the anatomical information embedded within. One solution is to interface a biomedical imaging data set with 3D printing technology to generate a physical replica. Here we detail a complementary method to visualize tomographic imaging data with a hand-held model: Sub Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. SSLE offers several unique benefits including: the facile ability to include anatomical labels, as well as a scale bar; streamlined multipart assembly of complex structures in one medium; high resolution in the X, Y, and Z planes; and semi-transparent shells for visualization of internal anatomical substructures. Here we demonstrate the process of SSLE with CT data sets derived from pre-clinical and clinical sources. This protocol will serve as a powerful and inexpensive new tool with which to visualize complex anatomical structures for scientists and students in a number of educational and research settings.

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

A methodology is described herein for representing anatomical imaging data within crystals. We create scaled three-dimensional models of biomedical imaging data for use in Sub-Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. This tool offers a useful complement to computational display or three-dimensionally printed models used within clinical or educational settings.

Scaled Modèle Anatomique Création d&#39;étiquettes de données biomédicale tomographique Imaging et associés pour subsurface Gravure au laser ultérieure (SSLE) de cristaux de verre

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...