CMOD Pack vous permet de modeler des cellules avec une très grande précision et de les mettre en culture en 2d ou 3d. Cela ouvre des opportunités pour étudier les interactions cellule-cellule et la morphogenèse de nouveaux tissus moteurs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à adopter pour d’autres laboratoires, elle ne nécessite pas de salle blanche, d’équipement spécialisé ou de réactifs synthétisés personnalisés.
Commencez par déposer de petites gouttes de la résine photo positive sur la lame d’aldéhyde, à l’aide d’une pipette jetable. Faites tourner la diapositive à 3000 tr / min pendant 30 secondes à l’aide du codeur de rotation, puis placez-la sur une plaque chauffante de 100 degrés Celsius pendant 1,5 minute pour réticuler la résistance photo. Retirez la diapositive de la plaque chauffante et placez un masque photo avec les caractéristiques souhaitées sur le dessus de la diapositive, alourdissez-la avec un morceau de verre et couvrez toute la configuration dans une boîte opaque.
Exposez la configuration avec une lampe UV pendant deux minutes, développez la lame en l’immergeant dans la solution de développement pendant trois à cinq minutes, puis rincez l’excès de solution de développement avec de l’eau, séchez-la sous un jet d’air ou d’azote. Observez cette lumière au microscope pour confirmer le succès de la photolithographie et la stocker dans l’obscurité. Ajouter une gouttelette de 20 oligos modifiés par 20 micromolaires d’amine sur chaque région à motifs photo de la lame et étaler doucement la gouttelette sur toute la région, en utilisant une pointe de pipette, en prenant soin, de ne pas rayer la lame, cuire la lame dans un four à 65 degrés Celsius jusqu’à ce que la solution d’ADN ait complètement séché, effectuer une amination réductrice en plaçant la lame cuite au four et un plat de culture cellulaire de 15 centimètres dans une hotte sur le dessus d’un shaker.
Mélanger doucement 100 milligrammes d’hydrure de boro de sodium dans 40 millilitres de PBS et l’ajouter au plat. Allumez ensuite le shaker pendant 15 minutes. Après la réaction, lavez cette lame deux fois avec du dodécylsulfate de sodium à 0,1% pour éliminer l’ADN non réagi.
Ensuite, lavez la lame trois fois avec de l’eau. Conduisez ce toboggan sous le flux d’azote ou d’air. Enfin, rincez-le avec de l’acétone pour enlever la résine photo restante.
Préparez une solution d’ancrage et d’adaptateur universel à quatre micromolaires comme décrit dans le manuscrit du texte et préparez une solution de co-ancrage universelle de 20 micromolaires dans PBS. Préparer la suspension cellulaire en remettant en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS glacé ou de milieu libre de sérum et transférer une à 3 millions de cellules dans une centrifugeuse à tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Centrifuger à 160 fois G pendant quatre minutes.
Resuspendez la pastille de cellule obtenue dans 75 microlitres de PBS glacé ou de milieu libre de sérum et ajoutez 75 microlitres de la solution d’ancrage et d’adaptateur universelle préparée pour micromolaire. Bien mélanger et incuber pendant cinq minutes sur de la glace, ajouter 15 microlitres de la solution universelle de co-ancrage au tube et bien mélanger, puis incuber l’échantillon pendant cinq minutes sur de la glace. Pour éliminer l’excès d’oligos de la suspension cellulaire, ajoutez un millilitre de PBS glacé ou de milieu libre de sérum dans le tube et mélangez avec une pipette.
Ar coupez les cellules en les centrifugant à 160 fois G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant. Répétez cette étape deux fois de plus. Resuspendez les cellules dans un col de glace PBS ou un milieu libre de sérum pour créer une solution dense cellulaire d’au moins 25 millions de cellules par millilitre, inclinez légèrement la glissière de motif, puis ajoutez 25 microlitres de cette suspension cellulaire à l’entrée de chaque cellule d’écoulement.
Retirez la solution PBS et 1% BSA de la sortie, ce qui permet à la suspension de la cellule de remplir la cellule d’écoulement des PDM. Incuber sur de la glace ou à température ambiante pendant 30 secondes, aspirer cinq microlitres de la suspension cellulaire à partir de la sortie de la glissière et les ajouter à nouveau dans l’entrée. Répétez cette opération 10 fois par cellule d’écoulement.
Pipettez doucement le PBS ou le milieu libre de sérum dans l’entrée de chaque cellule d’écoulement pour laver les cellules en excès et recueillir la suspension cellulaire de la sortie. Répétez cette opération deux à quatre fois jusqu’à ce qu’il ne reste plus de cellules en excès sur la diapositive. Pour la culture 3D, préparez une solution de précurseur d’hydrogel contenant 2% d’ARN et ajoutez-en 50 microlitres à l’entrée de chaque cellule d’écoulement.
Aspirer l’excès de liquide de la sortie, en conduisant la solution d’hydrogel dans la cellule d’écoulement. Incuber la lame à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes pour permettre aux hydrogels de se fixer et de cliver l’adhésion basée sur l’ADN entre les cellules et la surface. Ajouter 50 microlitres de précurseur d’hydrogel à un puits d’une glissière à deux puits ou d’une plaque à six puits.
Pipette 10 microlitres de PBS de chaque côté de chaque cellule d’écoulement. Répartissez-le sur toute la longueur de la cellule d’écoulement à l’aide d’une lame de rasoir ou trouvez une pince à épiler ponctuelle et soulevez doucement les côtés des cellules d’écoulement afin que le PBS se précipite sous le gel hydro. À l’aide d’une lame de rasoir, déplacez la cellule d’écoulement vers le bord de la glissière en inversant la lame et poussez la cellule d’écoulement hors de la glissière afin qu’elle atterrisse sur la lame de rasoir.
Choisissez la cellule d’écoulement de la lame de rasoir à l’aide de pinces incurvées. Inverser les cellules d’écoulement de sorte que les cellules soient sur le fond et les placer sur le dessus de la gouttelette de solution précurseur d’hydrogel. Incuber pendant au moins 30 minutes afin que l’hydrogel contenant les cellules de motif puisse se lier à la sous-couche d’hydrogel, ce qui entraîne l’intégration complète des cellules de motif.
Retirez la cellule d’écoulement et immergez-la complètement dans le support. Poussez doucement la cellule d’écoulement à l’aide de pinces incurvées jusqu’à ce qu’elle se détache et flotte dans le support, puis jetez-la. La quantification de l’adhésion des taches d’ADN aux cellules étiquetées CMO, qui augmente.
en fonction de la concentration de CMO est représenté comme la moyenne et l’écart-type de trois expériences. Les modèles d’ADN sont montrés dans le magenta et les cellules étiquetées CMO adhérées dans le cyan à différentes concentrations de CMO. Une comparaison des huvecs marqués CMO et des huvecs marqués LMO adhérés à un modèle d’ADN linéaire est présentée ici.
Un seul MDCK modèle VSC MOD pack, et transféré dans le gel maitre ont pu proliférer et polariser après cinq jours de culture. Des agrégats multicellulaires multicouches ont été créés en alternant des couches de cellules étiquetées avec des CMO complémentaires. Plusieurs populations cellulaires uniques peuvent être modelées ensemble avec une grande précision et sans contamination croisée.
Lors de la tentative de ce protocole, il est essentiel d’avoir une suspension cellulaire dense tout en ajoutant les cellules à la lame afin de maximiser les possibilités pour les cellules de coller aux taches d’ADN.
