Nous remercions le Dr Clemens gentiment Wendtner pour fournir lignée cellulaire tmuCD40-Ligand-HeLa.

Le protocole pour la génération de cellules murines B CD40-activé (mCD40B) à partir de splénocytes est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation d&#39;murin CD40 ligand (CD40L) exprimant des cellules HeLa (HeLa tmuCD40L), qui sera utilisé comme plate- liés cellules nourricières. Partie B décrit la réelle murin CD40-B de la culture. A. Préparation de cellules nourricières (tmuCD40L HeLa) Les cellules HeLa tmuCD40L est une adhérente lignée humaine de cellules épithéliales, qui ne devrait jamais devenir complètement confluentes. Les cellules sont donc découpé deux fois par semaine. La culture sur plus de six semaines n&#39;est pas recommandée. <ol><li> Retirer ancien milieu de la culture primaire avec une pipette stérile et laver les cellules avec 10 ml de PBS 1x. Aspirer le PBS après le lavage. </li><li> Ajouter 4 mL de 1x trypsine / EDTA dans un flacon de 75 cm2 pendant 10-15 minutes à 37 ° C. Utilisez tapotant doucement pour détacher les cellules. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de type sauvage et pivotant doucement pour arrêter la digestion à la trypsine. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml avec une pipette stérile et le spin des cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 mL de milieu de type sauvage. Comptez le nombre de cellules d&#39;une aliquote de la suspension cellulaire et préparer trois tubes de 50 ml avec le nombre approprié de cellules: <ol><li> 2,5 x 10 6 cellules pour une sous-culture </li><li> 0,4 x 10 6 cellules / puits pour l&#39;irradiation utilisée pour la culture de cellules CD40-B murines </li><li> restant à geler (si nécessaire). </li></ol></li><li> Faites tourner les cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes. </li><li> Enlever le surnageant. <ol><li> Pour repiquage: resuspendre 2,5 x 10 6 cellules dans 10 ml milieu de sélection dans un flacon de 75 cm2 de culture de cellules (2,5 x densité cellulaire 10 5 cellules / ml) et incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Fractionner les cellules deux fois par semaine. </li><li> Pour la culture de cellules CD40-B murines: Vous avez besoin de 2,4 x 10 6 cellules pour une plaque de 6 puits. Resuspendre les cellules HeLa tmuCD40L en milieu sauvage à une densité de 0,2 x 10 6 cellules / ml et les irradier à 78 Gy. Planche 2 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits et les incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Utilisez cette assiettes préparées pour la stimulation des lymphocytes B lors tmuCD40L cellules HeLa sont adhérentes (au moins 4 heures: vérifier l&#39;adhérence à l&#39;aide du microscope, ne pas attendre plus de 24 h pour commencer la stimulation des lymphocytes B). (Continuer avec B.) </li></ol></li></ol> B. murin CD40-culture de cellules B I. Préparation des splénocytes pour CD40-stimulation (jour 0): S&#39;il vous plaît noter: avant de continuer de s&#39;assurer que les cellules nourricières sont adhérentes. Toujours ajouter de nouvelles solutions d&#39;murin immédiatement interleukine-4, β-mercaptoéthanol et cyclosporine A au milieu de croissance avant l&#39;utilisation. <ol><li> Disséquer la rate de souris C57BL / 6 (haplotype H-2b) et il laver deux fois dans 10-20 ml de DMEM complété avec Gentamycine [15μg/mL] en le transférant avec une pointe de pipette 10 ml d&#39;un tube à l&#39;autre. Évitez les contaminants transfert (par exemple les cheveux) de la souris. Hacher la rate en passant à travers une passoire cellulaire (100 microns) et rincez avec un autre filtre de 10 mL de milieu. Isoler splénocytes à 265 xg pendant 7 min à température ambiante, les remettre en suspension dans 7mL muCD40-B milieu cellulaire, et les lymphocytes séparés par centrifugation de densité de Ficoll. Pour ce faire des cellules couche sur 5 ml souris Pancoll (préchauffé à la température ambiante) dans un tube de 15 ml et centrifuger à 450 xg pendant 30 min sans frein à la température ambiante. </li><li> Prélever la plupart de la couche supérieure, laissant intacte la couche de lymphocytes à l&#39;interface. Transfert couche de lymphocytes dans un nouveau tube de 50 ml, laver une fois avec 30 ml de DMEM avec Gentamycine [15μg/mL] en faisant tourner le bas à 265 xg pendant 7 min pour éliminer d&#39;autres cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu B mCD40-linge. Déterminer le nombre de cellules dans une aliquote de la suspension cellulaire. Déterminer le nombre de cellules en comptant une aliquote de la suspension cellulaire. </li><li> Isoler le montant requis de cellules à 265 xg pendant 7 minutes. Pour une plaque à 6 puits 5 x 10 6 cellules / puits sont nécessaires, donc 30 x 10 6 cellules par plaque. </li><li> Retirer le surnageant et remettre les lymphocytes à 1,25 x 10 6 cellules / ml dans mCD40-B milieu de culture fraîchement complété avec 1 U / ml d&#39;interleukine-4 comme facteur de croissance, 100 M β-mercaptoéthanol et 0,63 g / mL cyclosporine A pour prévenir la excroissance de cellules T (concentrations données se référer à un milieu de culture ml!). </li><li> Retirer le surnageant de la plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules HeLa tmuCD40L. </li><li> Ajouter délicatement 4 mL de la suspension lymphocytaire (1,25 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li&gt; <li> Au jour 3 reculture les cellules (Continuer avec II.1.). </li></ol> II. Repiquage de cellules mCD40B (3 jours et ensuite deux fois par semaine): <ol><li> Grappe des piles à Moisson mCD40B par vigoureusement aspiration et refoulement avec une pipette de 10 ml et de les mettre dans un tube de 50 ml. </li><li> Isoler à 265 xg pendant 7 minutes et remplacer complètement le surnageant avec mCD40-B milieu de lavage. Alors que le comptage des cellules du montant d&#39;une aliquote, tourner les cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes. Resuspendre les cellules dans mCD40B mCD40-B milieu de culture à une concentration de 0,75 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ajouter de nouvelles solutions d&#39;murin de l&#39;interleukine-4 à une concentration de 1 U / ml, 100 M β-mercaptoéthanol et 0,63 g / mL cyclosporine A dans le milieu. </li><li> Retirer le surnageant dans une plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules HeLa irradiées tmuCD40L. </li><li> Ajouter délicatement 4 mL de la suspension cellulaire mCD40B (0,75 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Encore une fois les cellules sous-culture tous les 3-4 jours pour finir avec très pure murin cellules B CD40-activé après un total de 14 jours. </li></ol> C. Dépannage: Que faire si le CD40-B cellules ne poussent pas? <ol><li> Avez-vous vérifié l&#39;expression du ligand CD40 des cellules nourricières? </li><li> Les cellules de la plaque liée alimentation utilisée pour la stimulation de plus de 24h? </li><li> Yat-il une contamination par des mycoplasmes? </li><li> Était la solution interleukine-4 utilisé pour la supplémentation fraîchement dégelé et at-elle avoir l&#39;activité biologique approprié? </li><li> Etait-β-mercaptoéthanol et la cyclosporine A a ajouté de la concentration correcte? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Figure 1 une" /> Figure 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Figure 1 b" /> Figure 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Figure 1 d" /> Figure 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2.

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives nationales et européennes pour garder des animaux de laboratoire. Se référant à la loi allemande du bien-être des animaux les animaux ont été contrôlés régulièrement par les autorités compétentes.

Modifications de ce protocole sont possibles, notamment sur l&#39;origine du CD40-stimulus et le type de souche de souris utilisée, également dans la production à rendement efficace de cellules murines B CD40-activé. Ahmadi et al. ont montré des résultats similaires pour les fibroblastes de souris transfectées avec CD40-ligand murin. Dans ce contexte de présentation xéno-antigènes peut être exclu avec certitude, mais des études intensives concernant la sécurité et la toxicité in vivo a donné auc...

A. Préparation des médias: <table border="1"><tbody><tr><td> Cellules nourricières type de support sauvages </td><td> Milieu de sélection de cellules Feeder </td><td></td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 300 pg / mL </td><td> L-Glutamine </td><td> 300 pg / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycine B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B milieu de lavage </td><td> mCD40-B milieu de culture </td></tr><tr><td> Réactifs </td><td> Concentration </td><td> Réactifs </td><td> Concentration </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 580 pg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 580 pg / ml </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Le glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Réactifs Divers: <table border="1"><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> AAP </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Sélectionnez Delta </td><td> Art Pas 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Aucun chat DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> AAP </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> AAP </td><td> Aucun chat P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinant murin interleukine-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 12340045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Cat No 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Fournitures diverses: <table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Ordonnance n </td></tr><tr><td> Stérile pipette </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-même la plaque </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tube conique </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> Aucun chat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

La recherche sur les cellules B CD40 a montré que l&#39;activation améliore leur capacité de présentation antigénique. Lorsqu&#39;ils sont stimulés par l&#39;interleukine-4 et CD40 ligand (CD40L), les lymphocytes B humains peut être étendu sans difficulté à partir de petites quantités de sang périphérique dans les 14 jours pour très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que des patients atteints de cancer<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Cellules CD40-B expriment des molécules importantes ganglion homing et peuvent attirer les cellules T<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. En outre, ils prennent efficacement, le processus et présentent les antigènes aux cellules T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Cellules CD40-B ont été montrés pour non seulement naïve écoute, mais également d&#39;élargir la mémoire des lymphocytes T<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Par conséquent CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été étudiés comme une source alternative de l&#39;immuno-stimulation des cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) à base de cellules immunotherapy1, 5,10. Afin d&#39;étudier plus avant si les cellules CD40-B induisent des réponses efficaces cellules T in vivo et d&#39;étudier le mécanisme sous-jacent, nous avons établi un système de culture cellulaire pour la génération de cellules murines B CD40-activé. Utiliser splénocytes ou purifiée cellules B de souris C57BL / 6 pour les CD40-activation, les conditions optimales ont été identifiées comme suit: A partir de splénocytes de souris C57BL / 6 (haplotype H-2b) de lymphocytes sont purifiées par centrifugation sur gradient de densité et de co-cultivées avec des cellules HeLa cellules exprimant recombinant murin CD40-ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Les cellules sont repiquées tous les 3-4 jours et les composants clés tels que CD40L, l&#39;interleukine-4,-mercaptoéthanol et la cyclosporine A sont reconstituées. Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé murin CD40-cellules B (mCD40B) avec APC-phénotype similaire aux humains CD40 des cellules B (figure 1a, b). CD40-stimulation conduit à une excroissance rapide et l&#39;expansion de la très pure (&gt; 90%) CD19 + cellules B dans les 14 jours de culture cellulaire (figure 1c, d). Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l&#39;expression du ligand CD40 murin sur les transfectants doit être contrôlée régulièrement (figure 2). Murin CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B et la différenciation ainsi que d&#39;étudier leur potentiel de fonctionner comme APC in vitro et in vivo. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour l&#39;établissement de la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs et aideront à répondre aux questions concernant la sécurité et l&#39;immunogénicité de cette approche<sup&gt; 12</sup&gt;.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure d&#39;activation de CD40-et à l&#39;expansion des cellules B murines à partir de splénocytes de souris C57BL / 6, qui peut être utilisé comme un modèle de cellule présentatrice d&#39;antigène (APC) pour étudier l&#39;induction de l&#39;immunité.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K vues.  University Hospital of Cologne. Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure d'activation de CD40-et à l'expansion des cellules B murines à partir de splénocytes de souris C57BL / 6, qui peut être utilisé comme un modèle de cellule présentatrice d'antigène (APC) pour étudier l'induction de l'immunité.