Nous remercions le Dr Noah Weisleder pour la lecture et l&#39;édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de la Fondation UMDNJ 62-09 à ZP, l&#39;American Heart Association SDG2630086 à XZ, 0535555N à MB, et National Institutes of Health RC2AR058962-01 à MB.

<ol>
	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29.">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li><li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+in+skeletal+muscle.">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells.">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li><li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+intracellular+Ca2++by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor.">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li><li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+store-operated+Ca2++entry+and+altered+Ca2++release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes.">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li><li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Bien que les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation pour le Ca 2 +-contraignant et Ca 2 + libre Fura-2 sont de 340 nm et 380 nm, respectivement, la meilleure gamme de rapport dynamique de Fura-2 pour le Ca 2 + mesure de la concentration peut se produire à des longueurs d&#39;onde autres dans un particulier Système de microscope. De tels changements de longueur d&#39;onde sont généralement dues à des changements dans le chemin optique avec l&#39;addition des différents composants optiques. Dans cette étude, les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation pour Fura-2 ont été déterminées comme 350 nm et 390 nm en effectuant une analyse spectrale de la fluorescence Fura-2. Le intracellulaire de Ca 2 + dans les résultats du cytosol à partir d&#39;un bilan de plusieurs sources, y compris intracellulaire de Ca 2 +, Ca 2 + extracellulaire entrée, ainsi que le Ca 2 + mécanisme d&#39;exclusion à la membrane du RE et du plasma. Pour isoler le unidirectionnelle SOC-médiation Ca 2 + afflux de Ca 2 + intracellulaire de libération et de Ca 2 + extrusion, le Mn 2 + dosage trempe peut être utilisé. Mn 2 + est connu pour être capable de pénétrer dans les cellules par l&#39;intermédiaire SOCE mais est imperméable à l&#39;extrusion de membrane de surface ou de l&#39;absorption ER par Ca 2 + pompes. Par conséquent, extinction de la fluorescence représente une mesure de unidirectionnel Mn 2 + dans des cellules de flux qui estime le degré d&#39;activation de SOCE. Mn 2 + dosage trempe est effectuée au point isobestique, à longueur d&#39;onde telle Fura-2 intensité de fluorescence est indépendante de la concentration de Ca 2 +. Le point isobestique pour chaque système doit être déterminé par balayage du spectre. En variante, Mn 2 + trempe peut être enregistrée par fluorescence ajusté à des deux longueurs d&#39;onde de telle sorte que la valeur finale est indépendante de la concentration de Ca 2 + 13. Pour obtenir de l&#39;information spatiale et temporelle de l&#39;activité de SOCE dans les muscles squelettiques, nous avons employé une méthode à double colorant, ce qui permet MeasureMe simultanéent de l&#39;activité SOCE et Ca 2 + contenu dans peau de mammifères adultes fibres musculaires EDL. La corrélation entre les variations de Ca 2 + contenu et SOCE activité peut être tracée pour indiquer le seuil et la sensibilité de l&#39;activation SOCE à l&#39;appauvrissement de la Ca SR de stockage de 2 +. La solution TT-chargement est optimisé pour de plus charger les T-tubules avec le Ca 2 + et pour l&#39;amorçage des T-tubules et la solution SR-chargement est destiné à promouvoir maximale Ca 2 + et de chargement en outre de charger les T-tubules avec ~ 500 pM Ca 2 +. FCCP est inclus dans la solution TT / SR-chargement, et la solution d&#39;appauvrissement SR pour éliminer les effets de la mitochondrie.

Table des réactifs spécifiques et des équipements: <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Vaisselle à fond de verre </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, l&#39;étanchéité, à l&#39;abri de la lumière, dissous dans le DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, joint étanche à l&#39;abri de light </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, l&#39;étanchéité, à l&#39;abri de la lumière </td></tr><tr><td> Quartz Cuvette </td><td> Cellules Starna </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargine </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-benzyl-p-toluène sulfonamide (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase de type I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Equipement: <ol><li> Un spectrofluorimètre (Photon Technology International, NJ): au xénon lampe à arc, contrôlé par ordinateur à grande vitesse monochromateur à accès aléatoire, basée sur la cuvette des émissions monochromateur, Nikon TE-200 Microscope inversé à fluorescencee, S Fluor objectif d&#39;huile 40x/1.30, détecteurs de PMT. </li><li> Microscope confocal à balayage laser (BioRad Radiance2100): laser à l&#39;argon 453/477/488/514, laser HeNe 543 nm, Nikon TE2000 microscope inversé, objectif 60X (NA 1.4, huile). </li><li> Un stéréomicroscope avec une puissance&gt; 100 grossissement (Zeiss Stemi SV11 Apo). </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

Magasin exploité Ca 2 + entrée (SOCE), plus tôt appelé capacitif Ca 2 + entrée, est un mécanisme étroitement régulé pour afflux de Ca 2 + extracellulaire dans les cellules pour reconstituer appauvri réticulum endoplasmique (RE) ou réticulum sarcoplasmique (SR) de Ca 2 + magasins 1,2. Depuis le Ca 2 + est un messager ubiquitaire seconde, il n&#39;est pas surprenant de voir que SOCE joue un rôle important dans une variété de processus cellulaires, y compris la prolifération, l&#39;apoptose de transcription du gène, et la motilité. En raison de sa grande fréquence dans presque tous les types cellulaires, y compris les cellules épithéliales et des muscles squelettiques, cette voie a suscité un grand intérêt 3,4. Cependant, l&#39;hétérogénéité des caractéristiques Socés dans différents types de cellules et la fonction physiologique ne sont pas encore clairement 5-7. Les propriétés fonctionnelles des canaux de SOCE peut être révélée par les études de patch-clamp, tandis qu&#39;un vaste corpus de connaissances sur les thivoie s a été acquise par basées sur la fluorescence intracellulaire de Ca 2 + des mesures en raison de sa commodité et de faisabilité pour criblage à haut débit. L&#39;objectif de ce rapport est de résumer quelques basées sur la fluorescence des méthodes pour mesurer l&#39;activation de SOCE dans les cellules, les cellules en suspension monocouches et les fibres musculaires 5,8-10. Le plus couramment utilisé de ces méthodes de fluorescence est de contrôler directement la dynamique de la concentration intracellulaire de Ca 2 + en utilisant le ratio de F et F 340nm 380nm (510nm pour les émissions de longueur d&#39;onde) de la ratiométrique Ca 2 + indicateur de Fura-2. Pour isoler l&#39;activité de SOCE unidirectionnelle de concentration intracellulaire de Ca 2 + et la libération de Ca 2 + extrusion, un Mn 2 + test trempe est fréquemment utilisé. Mn 2 + est connu pour être capable de pénétrer dans les cellules par l&#39;intermédiaire SOCE tandis qu&#39;il est imperméable à des processus de surface de membrane d&#39;extrusion ou d&#39;absorption ER par Ca 2 + pompes en raison de sa savoir très forte affinitéh Fura-2. En conséquence, l&#39;extinction de la Fura-2 fluorescence induite par l&#39;entrée de Mn 2 + extracellulaire dans les cellules représente une mesure de l&#39;activité de SOCE 9. Mesure ratiométrique et les dosages Mn +2 trempe peut être effectuée sur un spectrofluorimètre cuvette à base dans un mode population de cellules ou dans un système de microscope à base de visualiser les cellules uniques. L&#39;avantage des mesures de cellules uniques est que les cellules individuelles soumises à des manipulations génétiques peuvent être sélectionnées en utilisant la GFP ou journalistes de la DP, ce qui permet des études dans des cellules génétiquement modifiées ou muté. Les caractéristiques spatio-temporelles de SOCE dans le muscle squelettique structurellement spécialisée peut être réalisé dans les fibres musculaires à la peau par le suivi de la fluorescence simultanément de deux faible teneur en Ca 2 + affinité indicateurs ciblés dans des compartiments spécifiques de la fibre musculaire, comme Fluo-5N dans le SR et Rhod- 5N dans le sens transversal tubules 9,11,12.

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Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

L&#39;étendue de magasin exploité Ca<sup&gt; 2 +</supEntry&gt; (SOCE) peut être contrôlée à l&#39;aide fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicateurs. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Trempe de tests indicateurs SOCE dans des cellules cultivées et les fibres musculaires squelettiques tels. Une technique permettant la résolution spatiale et temporelle des SOCE par imagerie confocale de fibres musculaires mécaniquement décortiqués est également décrite.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

fluorescence-based-measurement-store-operated-calcium-entry-live

Research

JoVE Journal

Biology

21.0K vues.  Robert Wood Johnson Medical School. L'étendue de magasin exploité Ca 2 + (SOCE) peut être contrôlée à l'aide fluorescente Ca 2 + Indicateurs. Mn 2 + Trempe de tests indicateurs SOCE dans des cellules cultivées et les fibres musculaires squelettiques tels. Une technique permettant la résolution spatiale et temporelle des SOCE par imagerie confocale de fibres musculaires mécaniquement décortiqués est également décrite.