Nous tenons à remercier Alison Philbrook, Belinda Barbagallo et Michael Francis des commentaires perspicaces sur ce document. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par une bourse ZONE R15 1R15NS070172-01A1 attribué à MLL.

1 lamelle Préparation: Laver acide et Cuire <ol><li> Au moins 2 jours avant la dissection (étape 2), commencer les étapes suivantes pour préparer lamelles. Effectuer l&#39;étape de lavage à l&#39;acide pour éliminer les huiles et les lamelles de nettoyer à fond. </li><li> lamelles de charge en support de porcelaine qui positionne verticalement lamelles et les empêche de toucher l&#39;autre. Immerger support et des lamelles dans un récipient d&#39;histologie de verre rempli d&#39;acide chlorhydrique 2 M (HCl). Alternativement, si titulaire de porcelaine n&#39;est pas disponible, répartis ~ 20 lamelles horizontalement pour couvrir le fond de 100 mm verre boîte de Petri et plonger des lamelles dans du HCl 2 M. </li><li> Placez récipient en verre (avec des lamelles immergées dans de l&#39;acide) sur la table à bascule dans une hotte et permettre doux balancement pendant au moins 5 heures à température ambiante. Sinon, lavage à l&#39;acide lamelles de nuit dans les mêmes conditions. </li><li> Laver les lamelles couvre-objet avec H 2 O distillée (dH 2 O) par le transfert de porte-charge porcelaineavec des lamelles de HCl 2 M dans un récipient en verre propre de l&#39;histologie rempli avec dH 2 O. Sinon, décanter HCl 2 M de verre boîte de Pétri avec des lamelles et remplir avec dH 2 O. </li><li> Laver par décantation dH2Û nouveau et le remplissage récipient en verre avec dH frais 2 O. Répétez l&#39;opération pour un total de 3 lavages rapides. </li><li> Commencer plus laver régime en retournant récipient en verre (avec des lamelles et dH 2 O) sur la bascule. Permettre agitation douce pendant 10-30 min à température ambiante. Ensuite, décanter dH2Û et ajouter dH frais 2 O. Répétez l&#39;opération pour un total d&#39;au moins dix lavages. Sinon, continuer le lavage pendant la nuit. </li><li> Placez les lamelles dans le four préchauffé lavés à 350 ° C. Si vous utilisez titulaire de porcelaine, retirer le support de dH 2 récipient en verre O-rempli et puis placez support avec des lamelles directement dans le four. Si vous utilisez une boîte de Pétri en verre, décanter dH2Û et placer le plat en verre avec des lamelles dans le furnace. </li><li> Cuire les lamelles pendant au moins cinq heures ou toute la nuit à 350 ° C. </li><li> Après la cuisson est terminée, retirez les lamelles de porte en porcelaine avec des pinces fines et placez-le dans le verre 100 mm boîte de Petri stérile. Laissez lamelles qui n&#39;avaient pas été placés dans le support de porcelaine dans le verre boîte de Pétri. </li></ol> 2. Chick Dissection et isolement des DRG <ol><li> Retirer fertile, mise en scène White Leghorn poussin oeuf de l&#39;incubateur (tenue à 37 à 38,5 ° C avec doux balancement). REMARQUE: Des études antérieures ont utilisé jour embryonnaire 7-10 pour l&#39;isolement des DRG 2,8,11-13,16. </li><li> Placez l&#39;oeuf sélectionné dans une hotte à flux laminaire. Effectuer toutes les procédures indiquées ci-dessous dans des conditions aseptiques dans la hotte à flux laminaire avec des solutions et des instruments stériles. Préchauffer toutes les solutions dans un bain-marie à 37 °. </li><li> Crack œufs et placez le contenu dans une boîte de 100 mm de Petri en plastique. Utilisez une pince standard pour transférer l&#39;embryon à un autre de 100 mm boîte de Petri. </li><li&gt; aide d&#39;une pipette Pasteur, ajouter réchauffé PBS 1x boite de Pétri pour maintenir le tissu humide. Décapiter l&#39;embryon en pinçant le cou avec une pince fine. Transfert à un autre corps de 100 mm boîte de Petri propre. </li><li> Ajouter F12HS10 chaud (F12 de Ham, 10 mM d&#39;HEPES, 100 unités / ml de pénicilline, 0,1 mg ml de streptomycine, de sérum / 10% de veau foetal) à plat avec pipette Pasteur à garder tissu humide. Utiliser des pinces pour positionner embryon sur sa face dorsale (Figure 1A). </li><li> Placez 100 mm en plastique boîte de Pétri contenant du tissu embryonnaire sur un microscope binoculaire stéréoscopique de dissection dans une hotte à flux laminaire. Utilisez une pince fine à faire une incision verticale médiane de la queue à col en pinçant le derme de développement à exposer le coeur, les poumons et d&#39;autres organes. Sinon, faire une série de petites larmes pour exposer les organes internes. </li><li> Utilisent doucement 2 jeux de pinces fines stériles à: a) saisir le cou et b) saisir l&#39;aorte ou d&#39;autres tissus immédiatement supérieure à cœur et tirez vers la queue,éviscération de l&#39;animal. </li><li> Appliquer F12HS10 chaud avec pipette Pasteur pour les tissus. Utilisez une pince pour enlever les cardiovasculaires, les organes respiratoires ou digestifs restant à exposer les côtes en développement, la colonne vertébrale et les DRG (figures 1B-1D). </li><li> Sous le microscope de dissection, utiliser une pince fine pour éliminer davantage les organes et recueillir des DRG long des deux côtés de la colonne vertébrale lombaire, inférieur aux côtes. Recueillir DRG en pinçant DRG intactes de l&#39;embryon. Pincez et couper les racines qui s&#39;étendent du DRG vers la moelle épinière et le nerf de préhension en développement qui s&#39;étend de la DRG vers la périphérie ou vice versa. </li><li> Placez DRG intactes dans une boîte de culture de 35 mm rempli de F12HS10 chaud. Retirez tout excès de tissu, comme la dorsale ou ventrale racines qui peuvent avoir adhéré à DRG, des DRG intactes en boîte de 35 mm en pinçant avec une pince fine. </li><li> Pour obtenir des DRG supérieures à la région lombaire, retirez la moitié ventrale du thorax et cervical colonne vertébrale. Ceci est réalisé en effectuant une coupe dans la colonne vertébrale développement perpendiculaire à l&#39;axe de la colonne vertébrale dans la région cervicale supérieure et une autre coupe dans la région lombaire supérieure. Ensuite, faire des coupes parallèles à l&#39;axe de la moelle épinière le long de la côté gauche de la colonne vertébrale et de droite. Soulevez la moitié ventrale de la colonne vertébrale de l&#39;embryon, ce qui expose les expose la moelle épinière (figures 1E-1F). </li><li> Pour permettre un accès facile à DRG, retirer la moelle épinière thoracique et cervicale en saisissant la moelle épinière avec des pinces fines. Utilisez la pince pour soulever la moelle épinière de la colonne vertébrale. En première approximation, la moelle épinière thoracique se situe au niveau des nervures et de la zone du col est supérieure à celle des nervures. </li><li> Recueillir thoracique intact et DRG col de l&#39;utérus avec une pince fine et les placer dans F12HS10 chaud avec d&#39;autres DRG. Retirer l&#39;excès de tissu qui peuvent adhérer à DRG. </li><li> Rincer l&#39;intérieur d&#39;une nouvelle pipette Pasteur en verre avec F12HS10 pour aiderempêcher GHM de coller aux parois de la pipette. Utilisez pipette rincée à transférer tous les DRG et F12HS10 de petite boîte de Petri à un tube de 15 ml conique stérile et procéder immédiatement à l&#39;étape 3. NOTE: Plus d&#39;embryons peuvent être disséquées pour augmenter le nombre de DRG. DRG doivent être conservés dans F12HS10 à 37 ° C avant d&#39;être prêt pour l&#39;étape 3. </li></ol> 3. dissociation, enrichissante, et culture des neurones DRG - Partie 1 <ol><li> Placer le tube conique avec GHM intactes dans la centrifugeuse et doucement tourner (200 xg) pendant 2-3 min. Vérifiez que les DRG ont coulé au fond du tube. Sinon, tourner à nouveau. </li><li> Avec une pipette, enlever délicatement F12HS10, laissant DRG pastille intacte. Ajouter 2 ml de 1x calcium et de magnésium libre (CMF) PBS, déloger le culot de DRG. Spin et la retirer CMF PBS tout en laissant le culot de DRG intact. Répétez cette étape de lavage pour un total de trois lavages pour éliminer le sérum de veau fœtal dans F12HS10, qui pourrait interférer avec digestion par la trypsine à l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter 2 ml de trypsine réchauffé à tube de 15 ml contenant 2 ml de PBS et CMF DRG. Placer le tube dans 37 ° C bain d&#39;eau pendant 10-15 min à digérer DRG dans les cellules dissociées. </li><li> Pendant l&#39;incubation, faire F12H + supplément contenant médias (F12 de Ham, 10 mM HEPES 100 unités / ml de pénicilline, 0,1 mg / ml de streptomycine, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml de NGF, 200 mM de L-glutamine et N2) et chaud 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Typiquement, 10 ml de milieu totale est suffisante pour 4-5 plats de 35 mm de neurones sensoriels primaires. Aussi commencer la décongélation de la laminine-1 pour les lamelles de revêtement (étape 4). </li><li> DRG doucement triturer dans une solution de trypsine avec p1000 pipette et inspecter visuellement de l&#39;absence de DRG intactes. Continuer jusqu&#39;à ce que la trituration DRG intactes ne sont plus considérés par les yeux et / ou permettre plus trypsine incubation dans 37 ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que DRG intactes sont dissociés. Pour protéger les neurones de DRG de dommages, éviter les bulles d&#39;air lors de trituration et de limiter digestion par la trypsine à &lt;30 min. </li><li> CentrifugTube électronique contenant DRG dissociés et de la trypsine à 200 xg pendant 3 à 5 min pour former des pellets. Spin plus si nécessaire jusqu&#39;à ce culot est formé. </li><li> Aspirer soigneusement la trypsine sans perturber culot. Ajouter 2 ml de F12HS10 à sédimenter. Triturer doucement DRG avec une pointe de pipette P1000. </li><li> Transférer tous les contenus du tube de 15 ml conique dans 100 boîte de culture mm. Rincer le tube avec 8 ml F12HS10 et le transférer à la boîte de culture, de 2 ml à la fois pour un total de 10 ml. Cette étape de rinçage permet de recueillir les cellules qui auraient pu rester adhéré aux parois du tube. </li><li> Passer boîte de culture de 100 mm (10 ml F12HS10 et les cellules dissociées dans un DRG) humidifié à 37 ° C pendant 3 heures incubateur. REMARQUE: CO 2 n&#39;est pas nécessaire dans l&#39;incubateur parce HEPES tampons pH du substrat en l&#39;absence de CO 2. Pendant l&#39;incubation, les cellules gliales se lient à la surface du tissu plastique de la culture et les neurones ont tendance à adhérer de façon lâche au lit gliales. </li></ol> 4. Acid Washed revêtementLamelles et au four avec la laminine-1 <ol><li> Décongeler aliquotes stériles de la laminine-1 congelés sur glace. </li><li> Dans des conditions stériles, ajouter 1 ml de PBS stérile 1x 50 aliquote ul de la laminine-1. </li><li> Utilisation d&#39;un spectrophotomètre pour obtenir une valeur d&#39;absorbance de la laminine-1 à 280 nm. Utiliser cette valeur dans l&#39;équation suivante pour déterminer la concentration de la laminine-1. </li></ol> ABS = 280 (concentration mg / ml) * (coefficient d&#39;extinction de la protéine) Le coefficient d&#39;extinction pour la laminine-1 est de 0,86. <ol start="4"><li> Dans des conditions stériles, la laminine-1 dilué avec du PBS 1X à obtenir des concentrations de 1 mg / ml et 20 mg / ml. Utiliser ces deux concentrations appliquées de la laminine-1 pour obtenir une différence de dix fois de la laminine-1 lié à la lamelle couvre-objet (30 ng / cm 2 et 300 ng / cm 2, respectivement) après incubation 7,8,10. </li><li> Dans une hotte à flux laminaire, utilisez une pince fine à placer un lavé à l&#39;acide et au four coverslip dans le fond d&#39;une boîte de culture de 35 mm. Répéter au besoin pour obtenir le nombre de plats nécessaires. </li><li> Soumettre les lamelles couvre-objet à la lumière UV pendant 20 à 30 min de plus à assurer la stérilisation. Gardez le couvercle plat hors tension pendant cette étape. </li><li> Ajouter 400 ul de prêt laminine-1 à chaque lamelle de verre. Utilisez pointe de la pipette pour répandre la laminine-1 afin d&#39;assurer une couverture complète de la lamelle. La tension de surface permettra laminine-1 de rester sur la lamelle et ne se propage pas sur le fond du plat de la culture, qui est nécessaire. </li><li> Placer le couvercle sur plat et laissez la laminine-1 à incuber pendant 2-3 heures à température ambiante (3 heures est optimal). </li><li> Après la laminine-1 incubation, rincer les lamelles à l&#39;aide de la technique aseptique avec du PBS stérile en hotte à flux laminaire. Retirer solution sur lamelle et ajouter 400 ul de PBS. Attendez 5-10 min. Répétez l&#39;opération pour un total de 3 rinçages. </li><li> Laissez PBS sur lamelle après le dernier rinçage. Ne pas briser la tension de surface pendant le rinçage et ne permettent pas de lamelles de sécher. Lecouvercle ave jusqu&#39;à prêt à plaque neurones dissociés sur le coverlip. </li></ol> 5. dissociation, enrichissante, et culture des neurones DRG - Partie 2 <ol><li> Après incubation, utiliser une pipette stérile de 10 ml à rincer doucement le fond du plat de 100 mm contenant des cellules DRG dissociés. Tenez plat à ~ 45 °, tirez ~ 7 ml de F12HS10 avec l&#39;aide de la pipette, puis expulser doucement 7 ml sur environ 1/3 de plat. Répéter 5x, délogeant délicatement neurones. </li><li> Tournez plat et répéter le rinçage procédure, pour six rinçages, sur un autre tiers de l&#39;assiette. Répéter l&#39;opération à nouveau pour rester tiers de plat. De cette façon, les rincer doucement tout le fond du plat avec F12HS10 pour enlever les neurones. </li><li> Utilisant même pipette, transférer neurones F12HS10 contenant de 100 mm plat à 15 tube conique. Centrifuger pendant 5-10 min à 200 g pour sédimenter les cellules. </li><li> Retirer F12HS10, laissant pastille intacte. Remettre le culot avec 2 ml de F12H réchauffé + suppléments. </li><li&gt; Utilisez un hématimètre pour déterminer la densité cellulaire. </li><li> Diluer les cellules que nécessaire avec F12H + suppléments pour obtenir la concentration de placage souhaitée (120 000 cellules / ml pour des lamelles revêtues d&#39;/ ml de cellules 1 ug de la laminine-1 et 40 000 / ml pour des lamelles revêtues avec 20 ug / ml de laminine-1 8,16). </li><li> Retirer PBS à partir des lamelles de laminine-enduit et placer immédiatement 400 pi de cellules sur des lamelles. Soigneusement transférer à un plat humidifié, 37 ° C culture cellulaire incubateur. Laisser incuber pendant au moins une heure et jusqu&#39;à 3 heures pour permettre à des neurones à adhérer à la laminine-1. </li><li> Dans des conditions stériles, inonder doucement 35 mm plats neurones contenant 1,6 ml de F12H + suppléments. NOTE: A ce moment, la tension de surface sur la lamelle peut être rompu. Les neurones ont bien adhéré à la laminine-1 sur la lamelle. </li><li> Retour cellules dans l&#39;incubateur et incuber pendant la nuit. Réaliser des expériences telles que immunocytochimie le lendemain. </li></ol> 6. jemmunocytochemistry <ol><li> Avant l&#39;immunocytochimie, solution de fixation à chaud (4% de paraformaldéhyde, 30% de saccharose 2X PBS) à 37 ° C bain d&#39;eau. REMARQUE: Avant de cellules de fixation, traiter avec divers réactifs, tels que la nétrine-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, sémaphorine, et ephrin 16,29-31. </li><li> Retirer lentement 1 ml de 2 ml de F12H + suppléments de boîte de culture. Incorporer délicatement 1 ml de solution de fixation réchauffé. Laisser incuber à température ambiante pendant 10 à 15 min. </li><li> Retirez délicatement solution de fixation et ajouter 2 ml de PBS. Appliquer la solution vers le bord du plat, en évitant possible délogement des cellules fixes en raison de l&#39;application de PBS. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Répétez PBS lavage pour un total de 5 lavages. Ne laissez pas les cellules à sécher pendant une étape de immunocytochimie. </li><li> Retirer du PBS. Appliquer 1 ml de solution de blocage (0,1% de Triton-X, 1X PBS, 5% de sérum de chèvre normal). Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Sinon, pour tacher molécules de surface, Ne pas utiliser de Triton-X dans une solution de blocage 8. </li><li> Diluer anticorps primaires dans une solution de blocage par la recommandation de la fabrication. Utilisez 1: 500 pour les anticorps contre NCAM et activé β1 intégrines 16. Retirer la solution de blocage, ajouter 1 ml de solution d&#39;anticorps primaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer solution d&#39;anticorps primaire et ajouter 2 ml de PBS 1X. Incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante. Répétez l&#39;opération pour un total de 4 lavages PBS. Lavages peuvent être prolongés, si nécessaire. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire 1: 1000 dans une solution de blocage. Retirer PBS, ajouter 1 ml de solution d&#39;anticorps secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante. REMARQUE: Les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière. Conserver les solutions et les cellules dans l&#39;obscurité autant que possible de ce point en avant. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire et rincer 5x avec PBS 1x, comme précédemment. </li><li> Appliquer ~ 60-80 ul de FluoromountG sur une lame de microscope. En utilisant des pinces fines, soulevez doucement la lamelle sur plat et lamelle inférieure dans Fluoromount G sur lame de microscope. Éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Magasin glisse horizontalement à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Après 12-24 heures, Fluormount G va polymériser et lamelle sera fermement attaché à lame de microscope. des cellules de l&#39;image issue de cette étape de polymérisation est terminée. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+system-derived+chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+growth+cone+morphology+and+inhibit+neurite+outgrowth:+A+light,+epifluorescence,+and+electron+microscopy+study.">Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study.</a> Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).</li><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li><li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function.">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li><li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern.">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li><li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development.">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li><li>Honig, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility.">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li><li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons.">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li><li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues.">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li><li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression.">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li><li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture.">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li><li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion.">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li><li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord.">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour l&#39;isolement et la culture dissociés neurones sensoriels d&#39;un embryon de poulet. Cette procédure génère une population enrichie de neurones croissance robuste in vitro 7,8,10,16. De nombreuses techniques moléculaires et cellulaires peuvent être appliqués à ces neurones en culture, y compris l&#39;immunocytochimie, qui est décrit ici. Ce protocole a été récemment utilisée pour évaluer quantitativement l&#39;intensité des intég...

Les neurones sont des cellules complexes qui transportent l&#39;information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, la vision, le mouvement du moteur, l&#39;apprentissage et la mémoire. Unique à partir d&#39;autres types cellulaires, les neurones de bras s&#39;étendent processus analogue, appelés axones, pour former des autoroutes neuronaux essentiels pour la communication. Au cours de compartiments de développement spécialisée situés à l&#39;extrémité des axones en croissance, appelé les cônes de croissance, naviguer à travers un concert de signaux extracellulaires de mener l&#39;axone à sa destination appropriée. Les mécanismes moléculaires complexes qui sous-tendent cône navigation de croissance ne sont pas pleinement compris. Pour mieux comprendre ces mécanismes, les chercheurs ont utilisé des modèles de culture cellulaire pour étudier les neurones dans un environnement défini vitro et simplifiée. Etudier les neurones en culture 1 a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie des cellules neuronales, y compris: la différenciation neuronale 2, la dynamique du cytosquelette, l&#39;endocytose et le trafic, dendritesla réglementation 3,4, la régénération axonale 5, et les conditions cliniques telles que les neuropathies 6. En outre, des neurones en culture sont prêtent très bien à une large gamme de techniques de recherche, y compris immunocytochimie, la surface des cellules co-immunoprécipitation, Western blot, la transfection, l&#39;ARNi et imagerie en temps réel telles que l&#39;analyse de timelapse de la motilité du cône de croissance. Ainsi, la culture de neurones primaires est une approche puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie cellulaire des neurones. Le modèle de culture cellulaire fournit aux enquêteurs avec un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et les variables. Par exemple, le substrat sur lequel les neurones sont étalées (et poussent sur) peut être facilement manipulé. Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour produire deux substrats distincts, l&#39;un avec une faible concentration de la laminine-1 et l&#39;autre avec des concentrations saturantes de la laminine-1. De façon surprenante, des concentrations différentes de la même molécule peuvent avoir des effets dramatiquessur l&#39;état interne de neurones ainsi que leur composition de la surface cellulaire. Par exemple, les taux intracellulaires d&#39;AMPc et de surface niveaux de intégrines sont significativement différents dans les neurones étalées sur ces deux substrats 7,8. D&#39;autres études ont montré que d&#39;autres molécules, y compris la fibronectine et des protéoglycanes chondroïtine sulfate, l&#39;impact de l&#39;expression de molécules de surface cellulaire et la motilité des neurones 7-11. En outre, les molécules solubles tels que les neurotrophines et aussi l&#39;impact neurotropins composition de la membrane cellulaire et la motilité des neurones et de 12 à 16 peuvent être manipulés facilement et avec précision dans un modèle de culture cellulaire. Ici, nous décrivons les méthodes pour isoler et culture dissociés neurones sensoriels à partir d&#39;embryons de poulet. Cette procédure a été utilisée pour faire des percées significatives dans la neurobiologie, y compris la croissance axonale 5,7,8,10,11,16-21 et a été modifié à partir d&#39;une procédure visant à isoler les cellules ganglionnaires de la 22. Il y aplusieurs avantages à cette approche. Tout d&#39;abord, de nombreuses fonctionnalités de poussin ganglion de la racine dorsale (DRG) le développement sont bien caractérisés, y compris le délai de naissance, l&#39;extension de l&#39;axone, et les profils d&#39;expression de la protéine 2,23-28, fournissant ainsi une base instructive sur laquelle construire informative des expériences in vitro. Ensuite, les cultures neuronales dissociées permettent le chercheur d&#39;étudier plus directement les neurones par rapport à d&#39;autres approches utilisant des explants de DRG intacts (qui contiennent des neurones et des cellules non-neuronales) et / ou des cultures mixtes contenant à la fois des neurones dissociés et les cellules non-neuronales. Troisièmement, la procédure décrite ici est simple, peu coûteux et se prêtent à de premier cycle. Par conséquent, cette technique peut être utilisée pour la recherche ainsi qu&#39;à des fins d&#39;enseignement. En outre, des variations mineures de ce protocole devraient permettre rapide, à haut rendement purification des neurones à partir de sources autres que les DRG. Par exemple, cette procédure peut être modifiée pour fournir neuronale enriched cultures provenant d&#39;autres tissus tels que le cerveau antérieur ou de la moelle épinière embryonnaire. protocoles de immunocytochimie ont été optimisés pour ces cultures neuronales dissociées et sont décrits en détail ici. La procédure de double-immunocytochimie contre neural molécule d&#39;adhésion cellulaire (NCAM) et β1 des intégrines est fourni. Les données produites par ces méthodes immunocytochimiques ont été utilisées pour examiner la structuration spatiale et d&#39;intensité de plusieurs molécules dans des neurones en culture 8,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile small culture dishes (35mm)</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large culture dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">Falcon</td>
			<td style="width:135px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile large petri dishes (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">89000-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass petri dish (100mm)</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">D108962&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fine forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">standard forceps</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">1100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coverslips&#160; (22x22)</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:135px;">12 518 105K</td>
			<td>0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">porcelin coverslip holder</td>
			<td style="width:176px;">Thomas scientific</td>
			<td style="width:135px;">8542E40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td>use 50ml aliquots per 500 mls of Ham&#39;s F12 media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCL</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">VW3204-1</td>
			<td>use at 2M, can be used twice before discarding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9888</td>
			<td>use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">laminin-1</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">23017-015</td>
			<td>Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:176px;">cell treat</td>
			<td style="width:135px;">229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS CMF 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14200</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">14080</td>
			<td>used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ham&#39;s F12</td>
			<td style="width:176px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">12-615F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">10438</td>
			<td>use in F12HS20 at 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">H3375</td>
			<td>make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin streptomyocin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P0781</td>
			<td>use 5mls in 500mls of F12 media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NT3</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">GF031</td>
			<td>Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C&#160; non-defrosting freezer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td>&#160;aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,&#160; use 100ul per 10ml of F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NGF</td>
			<td style="width:176px;">RnD systems</td>
			<td style="width:135px;">256-GF</td>
			<td>Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">l-glutamine</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G7513</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T4049</td>
			<td>aliquot under sterile conditions, store at -20 0C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:176px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">Other items needed:&#160; general dissection instruments, including&#160; glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37&#160; degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immunocytochemistry Reagents Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S9378</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td>used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:176px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:135px;">0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">PCN500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microscope slides</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">16004-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibody against NCAM</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5032</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Antibody against activated beta 1 ingegrin</td>
			<td style="width:176px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MAB19294</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Seconday Antibody Table</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td>
			<td style="width:176px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of dissociated sensory neurons from chick embryos

Les neurones sont des cellules multiples qui transportent l&#39;information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, le mouvement du moteur, l&#39;apprentissage et la mémoire. Etudier les neurones in vivo peut être difficile en raison de leur complexité, leurs environnements variés et dynamiques, et des limitations techniques. Pour ces raisons, l&#39;étude de neurones in vitro peut s&#39;avérer bénéfique pour percer les mystères complexes de neurones. La nature bien définie de modèles de culture cellulaire un contrôle détaillé des conditions environnementales et des variables. Nous décrivons ici comment isoler, dissocier, et les neurones culture primaires d&#39;embryons de poulet. Cette technique est rapide, peu coûteux, robuste et génère croissance des neurones sensoriels. La procédure produit des cultures qui sont systématiquement hautement enrichies en neurones et a très peu de cellules non-neuronales (moins de 5%). Neurones primaires n&#39;adhèrent pas bien à verre non traité ou la culture de tissus en plastique, donc des procédures détaillées pour créer deux Distinct, bien définie substrats contenant de la laminine-pour le placage neuronale sont décrits. Des neurones en culture sont prête très bien à des techniques moléculaires et cellulaires multiples, y compris la co-immunoprécipitation, imaginer des cellules vivantes, ARNi, et immunocytochimie. Procédures pour le double immunocytochimie sur ces neurones en culture ont été optimisés et décrit ici.

Le protocole décrit ici, les enquêteurs de la culture une population enrichie de neurones sensoriels embryonnaires dissociées avec très peu de cellules (par exemple, &lt;5%) non-neuronales 7,8,10,16. De nombreux GHM peuvent être obtenues auprès du lombo-sacrée, thoracique et cervical. Selon les besoins de l&#39;enquêteur, les GHM de ces régions anatomiques distinctes peuvent être facilement isolés. Par exemple, la figure 1 montre des images de l&#39;embryon de poulet à tr...

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Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d&#39;isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l&#39;embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.

Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

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Neuroscience

14.2K vues.  Assumption College.  modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d'isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l'embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neurosciences

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned to completely random. In addition, fibers can be spun from a variety of materials, including biodegradable polymers such as poly-L-lactic acid (PLLA). These characteristics make electrospun fibers suitable for a variety of scaffolding applications in tissue engineering. Our focus is on the use of aligned electrospun fibers for nerve regeneration. We have previously shown that aligned electrospun PLLA fibers direct the outgrowth of both primary sensory and motor neurons in vitro. We maintain that the use of a primary cell culture system is essential when evaluating biomaterials to model real neurons found in vivo as closely as possible. Here, we describe techniques used in our laboratory to electrospin fibrous scaffolds and culture dorsal root ganglia explants, as well as dissociated sensory and motor neurons, on electrospun scaffolds. However, the electrospinning and/or culture techniques presented here are easily adapted for use in other applications.

Aligned electrospun fibers direct the growth of neurons in vitro and are a potential component of nerve regeneration scaffolds. We describe a procedure for preparing electrospun fiber substrates and the serum-free culture of primary rat E15 sensory (DRG) and motor neurons. Visualization of neurons by immunocytochemistry is also included.

La culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-L-lactide nanofibres

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation des neurones sensoriels de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

La production et l&#39;isolement des axones de neurones sensoriels de l&#39;analyse biochimique Utilisation des filtres poreux

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Enlèvement de<em&gt; Drosophila</em&gt; Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

L&#39;isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...