Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Le ganglion ciliaire de poulet, est une structure localisée dans la partie postérieure de l’oeil, adjacente au nerf optique dans la fissure choroïde. Et les neurones ciliaires ganglionnaires, appartiennent au système nerveux parasympathique, et sont des neurones cholinergiques, et donc ils peuvent établir des synapses cholinergiques. Le ganglion ciliaire se compose d’une énorme population de neurones ciliaires et de neurones choroïdiens, qui sont structurellement et fonctionnellement distincts.

Ainsi, les neurones ciliaires innervates muscle intraoculaire, et les neurones choroïdiens innervates muscle de l’humeur dans l’œil. Et pendant les premiers jours de la culture, les neurones ciliaires ganglionnaires présentent une morphologie multipolaire, et après ceux-ci, ils commencent à passer à un état unipolaire, où l’un des neurites s’étend et forme l’axone. Une des études les plus courantes utilisant des neurones ciliaires de ganglion, est une étude des synapses neuromusculaires, qui sont synapses cholinergiques, et l’utilisation des neurones ciliaires de ganglion est devenue une bonne alternative, comparée aux modèles précédents, dû au fait que la population neuronale obtenue, est homogène dans le sens que, tous les neurones sont cholinergic, et ainsi ils peuvent établir des synapses fonctionnelles avec les cellules de muscle , ce qui ne se produit pas lorsque nous travaillons avec une population neuronale, ce n’est pas entièrement cholinergique.

L’identification et la dissection du ganglion ciliaire peuvent être très difficiles pour quelqu’un qui le fait pour la première fois, donc ici nous fournissons un protocole étape par étape, pour l’identification appropriée et la dissection du ganglion ciliaire, ainsi que les lignes directrices pour la culture réussie de ces neurones. Pour la préparation des coverslips, vous aurez besoin, 13 millimètres de couvertures en verre, un récipient résistant à l’acide, 65% d’acide nitrique, pinces à épiler, eau Milli-Q, 75% d’éthanol et un shaker orbital. La préparation des coverslips pour les cultures primaires, doit être faite deux jours avant la procédure.

Placez le nombre désiré de couvertures de verre, à l’intérieur d’un récipient résistant à l’acide, et ajoutez 65% d’acide nitrique, jusqu’à ce que toutes les couvertures soient couvertes. Placez le récipient dans un shaker orbital et incubez toute la nuit à température ambiante avec agitation. Le lendemain, retirez soigneusement l’acide nitrique et l’étoile pour la réutilisation.

Laver les coverslips, ajouter de l’eau Milli-Q au récipient. Encore une fois, placer l’agitation pendant 30 minutes, jeter la solution de lavage, et répéter ce processus cinq fois. Rincer les coverslips deux fois à l’aide de 75% d’éthanol.

Séparez soigneusement et placez les couvertures individuelles dans une grille métallique, recouverte de papier d’aluminium, et incubez à 50 degrés, pendant 10 à 15 minutes, ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Stériliser les coverslips dans la lumière UV, pendant 10 à 15 minutes. Pour enduire les coverslips, vous aurez besoin, coverslips en verre stérile, une plaque de 24 puits, pinces stériles, 0,1 milligrammes par millilitre PDL solution, eau stérile, une solution de laminine de 10 microgrammes par millilitre, milieu neurobasal uni, et ganglion ciliaire milieu complet.

Le revêtement des coverslips, doit être fait la veille de la procédure. À l’aide d’une pince stérile, placer un coverslip dans chaque puits d’une plaque de 24 puits, ajouter 500 microlitres de solution poly dialyzing, à une concentration de 0,1 milligramme par millilitre, et incuber pendant la nuit à 37 degrés. Le lendemain, lavez les couvertures trois fois avec de l’eau stérile, jetez l’eau et ajoutez 350 microlitres de la solution laminine à une concentration de 10 microgrammes par millilitre à chaque puits.

Placer dans un incubateur, à 37 degrés pendant deux heures. Après ce temps, et avant le placage cellulaire, enlever la solution de laminine, et laver deux fois avec 300 microlitres de milieu neurobasal plaine. Ajouter 300 microlitres de milieu complet, et placer dans un incubateur, à 37 degrés et 5% de CO2, jusqu’à ce que vous soyez prêt à plaquer les cellules.

Pour la procédure de dissection, vous aurez besoin, oeufs de poulet au septième jour embryonnaire, 75% éthanol, forceps dissection numéro 545 et numéro 55, ciseaux, une cuillère, dissection boîtes petri avec fond noir et glace-froid solution HBSS. Assurez-vous de stériliser tous les outils de dissection dans 75% d’éthanol. Les œufs doivent être conservés à 16 degrés avant d’être incubés dans un incubateur d’œufs, à 37,7 degrés, pendant sept jours, ou à un autre stade embryonnaire désiré.

Le jour de la procédure, retirer les œufs de l’incubateur, pulvériser les œufs avec 75% d’éthanol. Obtenez le dessus de l’œuf à l’aide d’un ciseaux, et sortez soigneusement l’embroy à l’aide d’une cuillère. Placer l’embryon, dans une boîte de Pétri avec une solution HBSS glacée, et séparer immédiatement la tête du corps, en coupant dans la région du cou.

Ensuite, transférez la tête dans une nouvelle boîte de Pétri avec une solution HBSS propre et glacée. Dès que l’embryon est retiré de l’ovule, il est capable de produire des protéases qui sont responsables de la mort cellulaire. Il est donc important de séparer la tête du corps le plus rapidement possible, une fois que l’embryon est à l’extérieur de l’ovule pour minimiser la mort cellulaire.

Il est également très important de garder la tête de l’embryon dans la solution HBSS glacée. Tenez la tête de l’embryon vers le haut, et fixez-la dans le bec du poussin, puis commencez à enlever la mince couche de peau autour de l’oeil. Retirez soigneusement l’œil en le tournant doucement loin de la tête.

Et tout en séparant l’œil de la tête du poussin, remarquez le nerf optique étant sectionné. Gardez l’œil avec le côté postérieur vers le haut, et remarquez le ganglion ciliaire, à côté du nerf optique du capteur et de la fissure choroïde. Le nerf préganglionique pourrait encore être attaché au ganglion ciliaire, facilitant son identification.

Disséquer le ganglion ciliaire, de chaque œil, et le nettoyer très bien en enlevant l’excès de tissu. Transférer les ganglions disséqués dans une boîte de Pétri avec la solution HBSS sur la glace. Afin d’avoir un rendement d’environ 1 million de cellules par millilitre, vous devez disséquer environ 70 ganglions, et aussi garder à l’esprit que la population cellulaire obtenue, a des cellules non neuronales ainsi, afin de diminuer le nombre de cellules non neuronales, et aussi d’augmenter la pureté de votre population neuranale, il est important de nettoyer les ganglions ciliaires très bien , enlever tout l’excès de tissu.

Pour la dissociation des tissus, vous aurez besoin, d’une plaque 24-Well, d’une solution de 0,1% tripsin, d’un milieu incomplet de ganglions ciliaires, d’une pipette pasteur en verre poli par le feu et d’une pipette pasteur en plastique. Pré-mouiller une pipette stérile pasteur en plastique, et de recueillir toutes les ganglions ciliaires à un tube de 15 ML, et centrifugeuse pendant deux minutes à 200 Gs.Carefully, enlever tous les moyens HBSS, en utilisant une pipette pasteur pour enlever un plus grand volume, puis, lorsque vous êtes plus proche de la pastille, utiliser une pipette micro. Ajouter un millilitre de solution de 0,1% tripsin, et incuber pendant 20 minutes, à 37 degrés dans un bain d’eau.

Centrifugeuse pendant deux minutes, à 200 Gs.Immediately, enlever la solution tripsin, et ajouter un millilitre de milieu incomplet. Le sérum dans le milieu incomplet, arrêtera immédiatement l’activité de la trypsine. Centrifugeuse pendant deux minutes, à 200 Gs, et retirer tous les moyens.

Ajouter 500 microlitres de milieu complet, et commencer la dissociation des tissus à l’aide d’une micropipette P1000. Commencez par pipetage de haut en bas, 10 à 15 fois, puis, passer à un feu poli verre pasteur pipette, et encore une fois, pipette de haut en bas 10 à 15 fois. La suspension cellulaire doit devenir floue, comme un signe de dissociation réussie des tissus.

Le volume nécessaire pour dissocier les cellules dépend du nombre de ganglions ciliaires obtenus dans ce, et la taille des granulés. Lors de la tuyautage de haut en bas pour dissocier un tissu, il est important d’éviter les bulles d’air de formation, ce qui permettra de minimiser la perte de cellules. Après avoir réutilisé les cellules, vous pouvez laisser la suspension cellulaire sur la glace jusqu’au placage.

Déterminer la densité cellulaire à l’aide d’une solution bleu trypan, dans la chambre neubauer. Celui suspension de cellule de plomb dans le milieu complet, avec 5FTU, à la densité désirée et plaque 500 microlitres de cellules par puits. Incuber les cellules à 37 degrés et 5% de CO2.

Assurez-vous de vérifier notre culture tous les jours et de suivre le développement des cellules. Les ganglions ciliaires se développent assez rapidement in vitro, et après une journée, nous pouvons déjà voir quelques neurites s’étendant du corps cellulaire. Après sept à huit jours in vitro, le réseau neuronal est très bien établi, et les cellules peuvent être maintenues pendant au moins 15 jours.

Après une journée in vitro, les neurones ciliaires de ganglion montrent une mythologie multipolaire. Cependant, l’extension des neurites se produit rapidement dans les neurones visiblement établi le réseau neuronal, déjà après 24 heures. In vitro, les neurones ganglionnaires ciliaires sont responsables de l’innervation du muscle dans l’œil.

Et donc, ces cultures neuronales, sont très bien adaptées pour l’étude des synapses neuromusculaires. Pour cela, les neurones ganglionnaires ciliaires peuvent être plaqués sur les cellules musculaires. Ici, nous montrons une culture réussie, de l’œil vitreux, neurones CG, sur le dessus de l’œil V7 poussins neurones musculaires pectral.

Marqueur vésicule synaptique, SV2, montrent synapses actives qui sont établies entre les axones neurones CG, et les fibres musculaires, facilement identifiables par les noyaux multiples. Les neurones ciliaires de ganglion obtenus avec ce protocole conviennent à l’immunocytochimie, à l’électrophysiologie, et aux essais de survie entre autres. Ce protocole de dissection, donne un très faible nombre de neurones, mais si elle est faite correctement, fournira la population pure de neurones cholinergiques.

Il est très important que chaque ganglion soit très bien nettoyé et que l’excès de tissu soit enlevé. Pour cela, des instruments de haute qualité doivent être utilisés, de sorte que ce tissu peut être enlevé afin de prévenir la contamination par des cellules non neuronales. L’âge de l’embryon déterminera le succès de notre protocole.

Idéalement, la dissection doit être effectuée entre E7 et E8. Ce moment est très important parce qu’à ce stade, la mort des cellules développementales qui se produit normalement in vitro n’a pas encore eu lieu. Afin de minimiser la contamination de ces cellules non neuronales, nous utilisons 5FTU dans les médias de culture pour minimiser la croissance des cellules gliales et des fibroblastes. Ce modèle cellulaire offre une excellente alternative pour étudier votre maladie nueromusclar.

Sur la base de ce protocole, d’autres questions scientifiques peuvent être abordées, par exemple, comment la localisation sous-cellulaire de carbonates spécifiques et de protéines spécifiques régule la formation et la fonction de la synapse. En outre, il est assez facile d’établir des co-cultures de muscle nerveux pour répondre à d’autres questions comme l’étude des maladies neuromusculaires.