La recherche appuyée par la sentence de la NSF MCB-1021384.

1. Préparation du Tampon anaérobie <ol><li> Préparer 1 L de tampon phosphate 100 mM de potassium, pH 7,5. Verser 250 ml de tampon dans un flacon de 500 ml de Büchner avec un barreau aimanté. </li><li> Sceller la fiole avec un bouchon en caoutchouc et placez-le sur une plaque d&#39;agitation. Relier le tube court du ballon à une ligne de Schlenk. </li><li> Degas le tampon sous vide pendant 5 heures à température ambiante sous agitation. Durant cette période, effectuer 5 tours consécutifs de dégazage sous vide et le rinçage avec de l&#39;argon à chaque heure. </li><li> Rincer le flacon avec de l&#39;argon pendant 10 secondes et le débrancher de la chambre à vide. Placer le ballon à l&#39;intérieur de la boîte à gants. </li><li> Laissez le flacon ouvert dans la boîte à gants pendant la nuit avec une agitation vigoureuse. </li></ol> 2. Éliminer l&#39;oxygène de l&#39;arrêt du système d&#39;écoulement <ol><li> Préparer 1 L de 0,1 M acétate de sodium, pH 5,0. Verser 125 ml de ce tampon dans un flacon de 250 ml de Büchner et effectuez les étapes 01.02 à 01.04. </li><li> Peser 5mg de glucose oxydase à partir d&#39;Aspergillus Niger (181 300 U / g) et 0,9 g de glucose utilisant une 1,5 ml Eppendorf tube et 50 ml Falcon conique du tube, respectivement. Placez les deux conteneurs dans la boîte à gants. </li><li> Dissoudre la glucose oxydase et le glucose dans 50 ml d&#39;acétate de sodium 0,1 anaérobie M, pH 5,0 (concentrations finales de 18,13 U / ml et 100 mm, respectivement). Remplir les seringues de réservoir avec cette solution (Figure 1). </li><li> Assurez-vous que les vannes de commande sont dans le &quot;charge&quot; la position et de remplir les seringues d&#39;entraînement (Figure 1). Tournez la vanne F de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la mémoire tampon de F seringue lecteur à travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Répétez cette étape dix fois au total. Effectuez la même procédure avec les trois autres seringues entraînement. Attendre une heure. </li><li> Remplacer la solution des seringues réservoir avec le même tampon CONTAINing glucose oxydase et de glucose. Répétez l&#39;étape 2.4. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5 et permettre à la solution de se tenir dans le système d&#39;écoulement durant la nuit. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, répétez l&#39;étape 2.5. </li></ol> 3. Préparation du Tampon saturée en oxygène <ol><li> Préparer un tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5) et verser 50 ml dans un flacon de 50 ml avec un barreau aimanté. Boucher le flacon avec un bouchon Wheaton et un sceau d&#39;aluminium Wheaton. </li><li> Placez le flacon sur la glace. Immerger une longue aiguille reliée à un réservoir contenant de l&#39;oxygène à 100% dans la solution. Insérez un autre aiguille courte à travers le bouchon du flacon comme un évent. </li><li> Bubble la solution avec de l&#39;oxygène à 100% pendant 1 heure avec agitation. </li><li> Commencez par retirer l&#39;aiguille courte dans le flacon et attendre 10 secondes avant de retirer l&#39;aiguille longue. Placez le flacon fermé dans la boîte à gants. </li></ol> 4. Préparation de la solution de NADPH <ol><li> Peser à 1 mg de NADPH dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et placer it dans la boîte à gants. </li><li> Dissoudre le NADPH dans 300 pi de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium, pH 7,5. Retirez 30 uL de cette solution de la boîte à gants pour déterminer la concentration de NADPH avec un spectrophotomètre (e = 340 nm 6270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. Élimination de l&#39;oxygène de la solution enzymatique <ol><li> Prendre 400 ul de la solution mère enzyme du congélateur et du dégel dans la boîte à gants. La solution stock enzyme (360 uM) a été préalablement préparé dans un tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5) contenant 100 mM de NaCl, et congelés dans l&#39;azote liquide. </li><li> Transférer la solution d&#39;enzyme dans un flacon de 25 ml avec un barreau aimanté, plafonner le flacon avec un bouchon Wheaton et un sceau d&#39;aluminium Wheaton et de retirer de la boîte à gants. </li><li> Placez le flacon sur la glace et le connecter à une ligne de Schlenk en insérant une aiguille dans le bouchon du flacon. </li><li> Degas la solution enzymatique en effectuant 5 tours consécutifs dedégazage sous vide et le rinçage avec de l&#39;argon toutes les 20 minutes pendant 1 heure. </li><li> Rincer le flacon avec de l&#39;argon pendant 10 secondes et le débrancher de la chambre à vide. Placez le flacon sur la glace à l&#39;intérieur de la boîte à gants. </li></ol> 6. Demi-réaction réductrice: la réduction de surveillance Flavin <ol><li> Préparation de l&#39;instrument stopped-flow et le logiciel de contrôle Pro-Data pour le mode de mélange unique suivant le protocole du fabricant. </li><li> Tourner sur un bain d&#39;eau circulant (15 ° C). Éliminer l&#39;oxygène de l&#39;eau par barbotage d&#39;azote pendant 20 minutes. Cela empêche la contamination par l&#39;oxygène à travers le circuit d&#39;écoulement. </li><li> Maintenir la température des seringues d&#39;entraînement et la cellule d&#39;observation à 15 ° C en connectant le boîtier bain d&#39;eau de l&#39;arrêt d&#39;écoulement dans le bain circulant. </li><li> Dans la fenêtre Panneau de configuration de la baie de Pro-Data logiciels Photodiode de commande de sélection, de déclenchement externe (pour activer stopped-flow opération), et Logaritéchelle HMIC. </li><li> Lancez le logiciel de visualisation de données Pro-et de définir le répertoire où les fichiers de données seront stockées. </li><li> Remplacer la solution du réservoir seringues C et F avec anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5). Tournez la C et F vannes à la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Pousser le tampon de deux seringues d&#39;entraînement par l&#39;intermédiaire du circuit d&#39;écoulement en manuellement élever le disque correspondant ram cinq fois au total (clique vide avant chaque déplacement du coulisseau). </li><li> Afin d&#39;assurer que la glucose oxydase a été entièrement enlevée du circuit d&#39;écoulement, effectuer l&#39;étape 6.6 quatre fois au total. </li><li> Cliquez sur base du logiciel de contrôle Pro-Data. </li><li> Mélanger 100 ul de la solution mère enzyme avec 1100 ul de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (concentration finale après mélange dans le flux arrêté de 15 uM). </li><li> Remplacer la solution du réservoir syrF inge avec la solution d&#39;enzyme. Tournez la vanne F de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la solution enzymatique à partir de F seringue d&#39;entraînement à travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette opération trois fois au total. Dans le logiciel de contrôle Pro-données, définissez le temps d&#39;acquisition à 60 s. </li><li> Faire en sorte que les deux seringues d&#39;entraînement sont remplis avec les solutions correspondantes et l&#39;entraînement béliers sont en contact avec les pistons de seringue d&#39;entraînement. Tournez les deux vannes de la &quot;drive&quot; et cliquez sur la position dans l&#39;acquisition du logiciel de commande Pro-Data pour effectuer le lecteur. Répétez cette étape deux fois plus pour obtenir les données en trois exemplaires. Ce spectres rendements de la forme oxydée de l&#39;enzyme. </li><li> Utilisation de la valeur de A 452 nm obtenue à partir des disques, de déterminer la concentration d&#39;enzyme avant de les mélanger (e = 452 nm 13700 M -1 cm -1) et de préparer 4 ml d&#39;une solutio NADPHn de 1,5 fois plus concentrée. </li><li> Remplacer la solution de réservoir de seringue C avec la solution de NADPH et de vides et de remplissage de la seringue d&#39;arrêt trois fois comme décrit dans 6,10. </li><li> Répétez l&#39;étape 6.11. Ce spectres rendements lors de la réduction de l&#39;enzyme. </li></ol> 7. Oxydatif Demi-réaction: oxydation Flavin surveillance <ol><li> Préparation de l&#39;instrument stopped-flow et le logiciel de contrôle Pro-Data pour le mode de mélange à double suivant le protocole du fabricant. </li><li> Répétez les étapes 6,2-6,5. </li><li> Remplacer la solution dans les quatre seringues réservoir avec anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (pH 7,5). Tournez la vanne F de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Appuyez sur le tampon de la F seringue d&#39;entraînement à travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette étape cinq fois au total avec chaque seringue d&#39;entraînement. </li><li> Effectuez l&#39;étape 7.3 à quatre reprises en total pour supprimer complètement le contenu du circuit d&#39;écoulement. </li><li> Cliquez référence dans le logiciel de contrôle Pro-Data. </li><li> Mélanger 200 ul de la solution mère enzyme avec 1000 ul de anaérobie tampon phosphate 100 mM de potassium (concentration finale après mélange dans le flux arrêté de 15 uM). </li><li> Remplacer la solution de la seringue réservoir A avec la solution d&#39;enzyme. Tournez la vanne A de la &quot;drive&quot; la position. Vider la seringue arrêt en cliquant sur ​​Vider dans le logiciel de contrôle Pro-Data. Poussez la solution d&#39;enzyme de la seringue le lecteur A travers le circuit d&#39;écoulement manuellement élever le bélier lecteur correspondant. Effectuez cette étape trois fois au total. Dans le logiciel de contrôle Pro-Data, le temps de retard à 0,5 s et le temps d&#39;acquisition à 60 s. </li><li> Faire en sorte que toutes les seringues d&#39;entraînement sont remplis avec les solutions correspondantes et l&#39;entraînement béliers sont en contact avec les pistons de seringue d&#39;entraînement. Tourner toutes les vannes de la &quot;drive&quot; et cliquez sur la position d&#39;acquérir à l&#39;Pro-Datun logiciel de commande pour effectuer l&#39;entraînement. Répétez cette étape deux fois plus pour obtenir les données en trois exemplaires. Ce spectres rendements de la forme oxydée de l&#39;enzyme. </li><li> Remplacer la solution de la seringue réservoir B avec une solution de NADPH 1,5 fois plus concentrée que la solution d&#39;enzyme dans la seringue A. Tournez la vanne B de la &quot;drive&quot; la position vide et de remplissage de la seringue arrêt trois fois comme décrit en 7.7. </li><li> Remplacer la solution du réservoir seringue C avec un tampon oxygéné. Activer la soupape à l&#39;C &quot;d&#39;entraînement&quot; position et vide et de remplissage de la seringue d&#39;arrêt trois fois comme décrit en 7.7. Dans le logiciel de contrôle Pro-Data, le temps de retard et de l&#39;acquisition à 15 et 900 s, respectivement. </li><li> Répétez l&#39;étape 7.8. Ce spectres rendements au cours de la réoxydation de l&#39;enzyme complètement réduit. </li></ol> 8. Analyse des données <ol><li> Lancez le logiciel de convertisseur de Pro-Data. Cliquez sur l&#39;icône Options et sélectionnez Enregistrer dans ProDataCSV. </li><li> Ouvertle répertoire où les fichiers de données ont été stockées. Faites glisser les fichiers dans la fenêtre de convertisseur de Pro-Data APL. Les données seront sauvegardées automatiquement sous forme de fichiers au format CSV dans le même répertoire. </li><li> Ouvrez les fichiers au format CSV en utilisant Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Etats-Unis). Normaliser la base des traces arrêté débit en soustrayant l&#39;absorption correspondant à 700 nm. </li><li> Analyser les traces corrigées à l&#39;aide KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) en ajustant le terrain de l&#39;absorbance au maximum en fonction du temps correspondant à la fonction appropriée exponentielle. Comme le montre la figure 2B, l&#39;absorbance à 452 nm est tracée en fonction du temps afin de déterminer le taux de réduction de flavine après mélange l&#39;enzyme NADPH et dans l&#39;instrument arrêté-débit. Dans ce cas, le meilleur ajustement des données ont été obtenues en utilisant une double équation exponentielle et des taux de 0,65 et 0,23 s -1 ont été calculés pour la première et deuxième phases de la réduction, la chosepectivement. Pour déterminer le taux de formation de l&#39;intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin et la réoxydation après avoir fait réagir l&#39;enzyme réduit avec de l&#39;oxygène, nous avons analysé les traces stopped-flow à 380 et 452 nm, respectivement (figure 3B). En utilisant une équation unique exponentielle, on calcule les taux de 1,4 et 0,006 s -1 pendant la première étape et la deuxième de la demi-réaction d&#39;oxydation, respectivement. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Les résultats des expériences décrites dans les sections précédentes montrent comment le réductrice demi-réaction de A f Sida peut être surveillée en mesurant les changements de l&#39;absorbance à 452 nm, qui correspondent aux changements de l&#39;état redox de la flavine. Le taux de cette étape peut être déterminée en ajustant les données de l&#39;équation appropriée (Figure 2; étape 8.4). Le taux de réduction obtenu (0,65 s -1) est similaire à la valeur calculée avec k catl&#39;état d&#39;équilibre des expériences 2, suggérant que la réduction est le taux étape déterminante de la réaction. Profitant de la double mode de mélange de l&#39;arrêté-débit, le taux d&#39;oxydation et les intermédiaires dans cette demi-réaction peut être déterminée (figure 3; étape 8.4). Dans la réaction catalysée par l&#39;ASDI A f, le C4a-hydroperoxyflavin est clairement détecté (λ max de 380 nm), et le taux de formation et la décomposition peut être calculée. La lenteur de la réoxydation obtenu (0,006 s -1) indique que le C4a-hydroperoxyflavin est très stable en l&#39;absence de l&#39;ornithine. <img alt="Schéma 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Schéma 1. Mécanisme de A f Sida. L&#39;anneau isoallozaxine du cofacteur FAD est montré. Le oxydé flavine (A) se lie à la NADPH (B) et réagit pour former réduite flavine et du NADP + (C). Après réaction avec l&#39;oxygène moléculaire et de liaison deornithine, l&#39;C4a-hydroperoxyflavin est formée (D). Ce sont les espèces hydroxylation. Après l&#39;hydroxylation de l&#39;ornithine, l&#39;hydroxyflavin (E) doit être déshydratée pour former l&#39;enzyme oxydée. NADP + reste lié tout au long du cycle catalytique et est le dernier produit à être libéré (F). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;instrument stopped-flow. A) Image des composants de la SX20 Applied Photophysics stopped-flow spectrophotomètre. B) Image de l&#39;unité de traitement de l&#39;échantillon. C) schéma du circuit d&#39;écoulement en mode de mélange à double. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figure 2. La réduction anaérobie de Sida avec le NADPH dans l&#39;instrument stopped-flow. Quelques changements Spectral) enregistrés après le mélange des volumes égaux de 30 uM Sida et 45 uM de NADPH. Le premier spectre (oxydé Sida) et le spectre dernière (entièrement réduite SidA) est surligné en bleu et rouge, respectivement. Trace absorbance B) à 452 nm enregistrées en tant que fonction du temps. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figure 3. Oxydation du Sida dans l&#39;instrument stopped-flow. A) les modifications spectrales enregistrées après mélange des volumes égaux de l&#39;Asdi et totalement réduit tampon oxygéné. Les concentrations finales étaient de 15 uM, l&#39;Asdi 22,5 uM NADPH, d&#39;oxygène et 0,95 mM. Le spectre enregistré à 0,034, 4,268, et 727.494 s correspond à l&#39;enzyme complètement réduit, le produit intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin (λ max de 380 nm), et l&#39;enzyme oxydée (λ max de 450 nm), respectivement. B) trace l&#39;absorbance à 382 et 452 nm enregistrée en fonction du temps.

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les enzymes qui catalysent les réactions d&#39;oxydo-réduction contiennent généralement des cofacteurs tels que hèmes et flavines qui subissent des changements d&#39;absorbance significative au cours du cycle catalytique. La forme oxydée de la flavine présente des maxima d&#39;absorbance à environ 360 et 450 nm, et sa réduction est généralement contrôlée par suite de la diminution d&#39;absorbance à 450 nm 7. En général, certains intermédiaires transitoires sont présents, mais la forme et la pourriture trop rapide pour être mesurée en spectrophotomètres réguliers. Utilisation de la photophysique appliquée SX20 stopped-flow spectrophotomètre (ou instruments similaires), il est possible de mesurer les changements d&#39;absorbance dans l&#39;échelle de la milliseconde (temps mort, 2 ms). Ici, nous avons étudié les réductrices et l&#39;oxydation des demi-réactions de la monooxygénase flavine-dépendante Une Sida f, en servant de modèle. Le taux de transfert d&#39;hydrure est déterminée en mesurant le changement de l&#39;absorbance à 452 nm après le mélange avec l&#39;enzyme NADPH dans des conditions anaérobies. Par la suite, en tenant Advantage de la double mode de mélange de l&#39;instrument arrêté-débit, l&#39;enzyme a été mis à réagir avec le NADPH, jusqu&#39;à réduction complète a été atteint, puis l&#39;enzyme réduite-NADP + complexe est mélangé avec de l&#39;oxygène. Suite à cette procédure, il est possible de détecter transitoires intermédiaires oxygénés flavine et de mesurer les taux de formation et de décomposition. L&#39;identification de ces intermédiaires fournit des données expérimentales sur la nature des espèces réactives en catalyse. Dans le cas de A f Sida, la formation de la C4a-hydroperoxyflavin (généralement suivi au 370-380 nm), ce qui est des espèces hydroxylation. En outre, la mesure de la constante de vitesse de chaque étape permet d&#39;obtenir des informations sur l&#39;étape déterminante de vitesse de la réaction et de contribuer à élucider les mécanismes cinétiques et chimiques de l&#39;enzyme. En général, des approches similaires peuvent être utilisés pour d&#39;autres flavoenzymes, ou des protéines pour lesquelles l&#39;absorbance changements se produisaient, tels que les protéines qui contain hème, le pyridoxal-phosphate, ou le fer non hémique 8-10. Une limitation de cette méthode est que de grandes quantités de l&#39;enzyme purifiée sont nécessaires, mais cela peut être surmonté en utilisant un système d&#39;expression avec des rendements élevés. On détermine la concentration optimale en protéines pour les spectres d&#39;enregistrement en utilisant suffisamment de protéines de sorte qu&#39;un signal assez fort peut être observé, mais pas trop afin que l&#39;enzyme ne soit pas gaspillé. En règle générale, la plus faible concentration d&#39;enzyme pour la flavine contenant les enzymes utilisées dans stopped-flow expériences est de 6-10 um (après mélange) et est déterminée en utilisant le coefficient d&#39;extinction molaire correspondante de l&#39;enzyme. Dans le cas de A f Sida, le pourcentage de la DCP enzyme liée est 50-65% 2. Apo-protéine est considérée comme inactive dans ces expériences, car un cofacteur FAD lié est nécessaire pour la catalyse. Une autre limite possible de cette méthode est que si les processus dans une enzyme se produisent plus rapidement que 2 ms (temps mort de l&#39;stopped-flow), ils ne seront pas respectés, mais eavant sont fait état de stratégies où les taux peut être réduit à surmonter ce problème. Un exemple pour ce comprend l&#39;utilisation d&#39;une concentration élevée de NaCl dans la réaction d&#39;un ferrédoxine-NADP + réductase 11. Le lavage de l&#39;oxygène à partir du circuit d&#39;écoulement de l&#39;arrêté-débit est souvent une étape délicate dans cette expérience et nécessite une attention particulière. La glucose-oxydase-glucose système décrit ici est utilisé avec succès dans la plupart des laboratoires car elle est une méthode efficace et peu coûteux. Cependant, il ya quelques inconvénients qui comprennent la production de H 2 O 2 et pour certaines applications d&#39;autres alternatives que la protocatéchuate dioxygénase-protocatéchuate système doit être considéré 12. L&#39;utilisation d&#39;une boîte à gants anaérobie rend plus facile à assurer des conditions anaérobies, mais n&#39;est pas indispensable. L&#39;oxygène doit être retirée du circuit d&#39;écoulement de l&#39;stopped-flow que nous voulons l&#39;enzyme à être réduit en l&#39;absence d&#39;oxygène ou de réagir avec l&#39;oxygène à une concentrations que nous spécifions. Bien que le stopped-flow est dans la boîte à gants, il est de l&#39;oxygène dans le circuit d&#39;écoulement, si nous avons utilisé des tampons aérobies dans les expériences précédentes. En plus de mesures d&#39;absorbance, de fluorescence et de tests de dichroïsme circulaire peut être effectué dans le Laboratoire de photophysique appliquée SX20 stopped-flow spectrophotomètre avec les accessoires correspondants.

<table border="1"><tbody><tr><td> Général de Laboratoire </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner flacons </td><td> Pêcheur </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Incorporer les bars </td><td> Pêcheur </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Incorporer plaques </td><td> Pêcheur </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Lignes Schlenk </td><td> Kontes verre </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon réservoir </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Réservoir d&#39;azote </td><td> Airgas </td><td> Ni200 </td></tr><tr><td> Réservoir d&#39;azote, ultra haute pureté de qualité </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Ballon d&#39;oxygène </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% d&#39;hydrogène du réservoir d&#39;azote équilibre </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop-débit spectrophotomètre </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Boîte à gants </td><td> Timide </td><td> - </td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fournitures </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml BD Falcon tubes </td><td> Pêcheur </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ml BD Falcon conique tubes </td><td> Pêcheur </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 mL à centrifuger Eppendorf </td><td> Pêcheur </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 et 25 flacons de verre mL </td><td> Pêcheur </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Bouchons en caoutchouc </td><td> Pêcheur </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Joints en aluminium </td><td> Pêcheur </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le phosphate de potassium, monobasique </td><td> Pêcheur </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique </td><td> Pêcheur </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> L&#39;acétate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> La glucose oxydase à partir de A. Niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Pêcheur </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Pêcheur </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornithine chlorhydrate </td><td> Pêcheur </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus sidérophore A (Sida) est une monooxygénase DCP-contenant qui catalyse l&#39;hydroxylation de l&#39;ornithine dans la biosynthèse de sidérophores hydroxamate qui sont essentiels pour la virulence (par exemple ferricrocin ou N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. La réaction catalysée par l&#39;ASDI peut être divisé en réduction et par oxydation des demi-réactions (schéma 1). Dans le réductrice demi-réaction, le FAD oxydé lié à A f Sida, est réduite par le NADPH 2,3. Dans le demi-réaction d&#39;oxydation , le cofacteur réduit réagit avec l&#39;oxygène moléculaire pour former un intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin, qui transfère un atome d&#39;oxygène à l&#39;ornithine. Ici, nous décrivons une procédure pour mesurer les taux et de détecter les différentes formes spectrales de l&#39;Asdi en utilisant un instrument stopped-flow installé dans une boîte à gants anaérobie. Dans l&#39;instrument arrêté-débit, de petits volumes de réactifs sont rapidement mélangés, et après l&#39;écoulement est interrompu par eSeringue d&#39;arrêt e (Figure 1), les changements spectraux de la solution placée dans la cellule d&#39;observation sont enregistrées dans le temps. Dans la première partie de l&#39;expérience, nous montrons comment nous pouvons utiliser l&#39;instrument stopped-flow en mode unique, où la réduction anaérobie de la flavine en A f Sida par le NADPH est mesurée directement. Nous utilisons ensuite doubles paramètres de mélange où A f Sida est d&#39;abord anaérobie réduit par le NADPH pour une période déterminée de temps dans une boucle du vieillissement, et ensuite mis à réagir avec l&#39;oxygène moléculaire dans la cellule d&#39;observation (figure 1). Afin de réaliser cette expérience, tampons anaérobies sont nécessaires parce que lorsque seul le réductrice demi-réaction est suivie, tout l&#39;oxygène dans les solutions réagissent avec le cofacteur réduit flavine et former un intermédiaire C4a-hydroperoxyflavin qui finira par se désintégrer de nouveau dans la forme oxydée flavine . Ce ne serait pas permettre à l&#39;utilisateur de mesurer avec précision les taux de réduction car il serait le chiffre d&#39;affaires complet de l&#39;enzYme. Lorsque le demi-réaction d&#39;oxydation est étudiée l&#39;enzyme doit être réduite en l&#39;absence d&#39;oxygène de sorte que seulement les étapes de réduction et d&#39;oxydation entre sont observées. L&#39;un des tampons utilisés dans cette expérience est saturée en oxygène afin que nous puissions étudier la demi-réaction d&#39;oxydation à des concentrations plus élevées d&#39;oxygène. Ce sont souvent les procédures mises en oeuvre lors de l&#39;étude, soit les réductrices ou oxydatif demi-réactions à la flavine contenant monooxygénases. L&#39;échelle de temps des expériences pré-état d&#39;équilibre réalisées avec le stopped-flow est millisecondes à quelques secondes, qui permettent la détermination des constantes de vitesse intrinsèques et la détection et l&#39;identification des intermédiaires dans la réaction 4. Les procédures décrites ici peuvent être appliqués à d&#39;autres flavine-dépendantes monooxygénases. 5,6

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Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;un instrument stopped-flow d&#39;enquêter sur les deux réductrices et l&#39;oxydation des demi-réactions de<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Un sidérophore (Asdi), une monooxygénase flavine-dépendante. Nous montrons ensuite les spectres correspondant à des espèces dans la réaction de l&#39;Asdi et nous calculons les constantes de vitesse de leur formation.

Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d&#39;une monooxygénase flavine-dépendante à l&#39;aide Stopped-Flow Spectrophotométrie

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K vues.  Virginia Polytechnic Institute and State University. Nous décrivons l'utilisation d'un instrument stopped-flow d'enquêter sur les deux réductrices et l'oxydation des demi-réactions de Aspergillus fumigatus Un sidérophore (Asdi), une monooxygénase flavine-dépendante. Nous montrons ensuite les spectres correspondant à des espèces dans la réaction de l'Asdi et nous calculons les constantes de vitesse de leur formation.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Recherche

Bio-ingénierie

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

Suivi des Mécanique mur pendant le déploiement du stent dans un vaisseau

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Cathéter de lumière à tir latéral intra-cardiaque pour la surveillance du métabolisme cellulaire à l'aide de la spectroscopie d'absorption transmurale des cœurs de mammifères perfusés

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Évaluation de l’électrophysiologie cardiaque préclinique par la double tension et la cartographie optique du calcium des tranches cardiaques organotypic humaines

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Imagerie et quantification de la zone des microbulles en mouvement rapide à l’aide d’une caméra à grande vitesse et d’une analyse d’images

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.