Ce travail a été soutenu par des subventions de la Santé nationale et du Medical Research Council de l&#39;Australie (NHMRC) (526 615 545 906 et) et en partie par le programme gouvernemental victorienne OIS. DS est un membre de NHMRC.

1. Préparation de la [3 H]-cholestérol <ol><li> Dans la hotte, distribuer la quantité requise de cholestérol [3 H] dans un tube de 1,5 ml de micro (0,5 pCi (19 kBq) par puits est nécessaire pour un essai typique). </li><li> Si [3 H]-cholestérol est en suspension dans le toluène, le sécher complètement avec du gaz N2 et remettre en suspension avec de l&#39;éthanol à 100% pour une concentration finale de 1 pCi (37 kBq / ul. Vortex et bien mélanger. </li></ol> 2. Étalement des cellules et à l&#39;étiquetage du cholestérol cellulaire Ce protocole a été testé en utilisant les types de cellules suivants: 4,5 monocytes humains THP-1, les monocytes-macrophages humains 6,7,8, RAW 264.7 de macrophages murins 5,9,10,11, les cellules HeLa 12, veine ombilicale humaine endothéliale cellules (HUVEC), des cellules BHK-21 9, les fibroblastes humains et de souris, les cellules HepG2 13,14 hépatocarcinome humain 15 et, dans une forme modifiée, à partir de plaquettes &lt;sup&gt; 16. <ol><li> Remettre en suspension les cellules et les compter. Cellules de la plaque dans des plaques 12 puits à la densité finale de 0.2x10 6 cellules par puits dans 0,9 ml de milieu complet. Cellules continuera de croître et atteindra 0.8x10 6 cellules par puits au moment de l&#39;expérience efflux. Pour les cellules qui ne se divisent pas, comme différenciées cellules THP-1, la densité de semis doit être 0.8x10 6 cellules par puits. Si vous utilisez 6 - ou plaques à 24 puits, double ou la moitié du nombre de cellules par puits, respectivement. Le nombre de puits devrait être suffisant pour les déterminations de quadruples pour chaque condition expérimentale. </li><li> Si la différenciation des cellules THP-1 est nécessaire, ajouter PMA (concentration finale 0,1 pg / ml) pour les médias pendant 48-72 h. </li><li> Ajouter une petite aliquote des médias dans le microtube contenant la [3 H] cholestérol. </li><li> Laver les côtés du tube avec les médias avant d&#39;ajouter [3 H] cholestérol dans une partie aliquote de séparée des médias complets (100 pl / puits). </li> &lt;li&gt; Ajouter des médias contenant [3 H] cholestérol dans les puits avec des cellules (volume final par puits est de 1 ml). Si aucun traitement de cellules est nécessaire avant le marquage, les cellules peuvent être étalées dans la [3 H] cholestérol milieu contenant. </li><li> Incuber les cellules pendant 48 heures dans incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2). </li></ol> 3. Incubation d&#39;équilibration <ol><li> Après 48 heures d&#39;incubation, vérifier les cellules sous le microscope. Assurez-vous qu&#39;ils sont en bonne santé et sont à environ 80% de confluence. </li><li> Retirez le support contenant [3 H] cholestérol. Laver les cellules délicatement avec du PBS. Répétez 3 fois de lavage. </li><li> Préparer un milieu sans sérum. Si nécessaire, activer les cellules en ajoutant un agoniste LXR (comme A-901 317 à 1-4 mmol / L) ou d&#39;AMPc (0,3 mmol / L; pour les cellules d&#39;origine de la souris uniquement) pour le sérum de libre-médias. </li><li> Ajouter 500 ul milieux exempts de sérum dans chaque puits. </li><li> Incuber pendant 18 heures dans l&#39;incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Incubation efflux de cholestérol <ol><li> Après 18 heures d&#39;incubation dans un milieu sans sérum, vérifier les cellules sous le microscope. Assurez-vous qu&#39;ils sont en bonne santé et anastomosé (minimum de 80% de confluence). </li><li> Préparer une solution de cholestérol accepteurs d&#39;efflux dans un milieu sans sérum. Exemples d&#39;accepteurs comprennent: L&#39;apolipoprotéine AI (apoA-I) (concentration finale de 10 pg / ml) Lipoprotéines de haute densité (HDL) (concentration finale de 20 pg / ml) Cyclodextrine (concentration finale 200 pg / ml) Plasma (concentration finale 1-2%) </li><li> Laver les cellules délicatement avec du PBS. </li><li> Ajouter 250 pi de milieu sans sérum avec des accepteurs à chaque puits. </li><li> Laisser un ensemble de puits pour déterminer fond efflux (efflux de milieux exempts de sérum avec NO accepteur) </li><li> Incuber les cellules pendant 2 heures dans incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2). Durée de l&#39;incubation efflux peut varier de 30 min à 8 h si nécessaire. </li></ol> 5. Traitement Samples <ol><li> Après 2 heures d&#39;incubation vérifier cellules sous le microscope. </li><li> Recueillir des médias dans 1,5 ml microtubes. Centrifuger à 14000 rpm pour 1-10 min à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Transfert de 100 médias ul en 7 ml flacon à scintillation. Ajouter 5 ml d&#39;Insta-Gel Plus (PerkinElmer) et le mélange de vortex. Conserver les échantillons restants à 4 ° C. </li><li> Placez les plaques dans le congélateur pendant 30 minutes. Ajouter 500 ul dH 2 O dans chaque puits. Vérifiez les cellules sous le microscope pour s&#39;assurer que toutes les cellules ont levé du fond de puits. Si encore adhérent, soit laisser les assiettes avec dH 2 O à 4 ° C durant la nuit ou gratter les puits. </li><li> Une fois que toutes les cellules ont décollé, pipeter et pour briser les mottes de cellules. Transférer 100 ul en 7 flacons de scintillation ml. Ajouter 5 ml d&#39;Insta-Gel Plus (PerkinElmer) et le mélange de vortex. Stocker les plaques restantes à 4 ° C. </li><li> Placez des flacons à scintillation sur un compteur à scintillation. Configurer compteur pour compter de [3 H] dansunités dpm. </li></ol> 6. L&#39;analyse des résultats <ol><li> Le taux de l&#39;efflux de cholestérol est habituellement exprimé en proportion du cholestérol déplacé à partir de cellules à l&#39;accepteur. La formule suivante est utilisée: </li></ol><img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2"><li> L&#39;efflux spécifique est calculé comme une différence entre l&#39;efflux de la présence ou l&#39;absence de l&#39;accepteur (vide). </li></ol><img alt="L&#39;équation 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7. Chronologie <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8. Les résultats représentatifs Un exemple de résultat d&#39;une expérience d&#39;efflux de cholestérol est indiqué dans la Fig. 1. Dans cette expérience, THP-1 monocytes humains ont été différenciées en macrophages et l&#39;efflux de cholestérol à des accepteurs différents étaittesté. Efflux de cholestérol à moyen sans accepteurs (&quot;blank&quot;) était de 0,79% et cette valeur a été considérée comme un efflux non spécifique et a été soustraite des autres valeurs. Efflux de cholestérol pour la santé humaine apoA-I (concentration finale de 30 pg / ml) était de 4,75%. Un échantillon de plasma de référence a été inclus dans cette expérience pour surveiller la variabilité inter-expérimentale. Un échantillon de référence peut être utilisé pour la normalisation des données à travers un grand nombre d&#39;expériences, mais nous avons trouvé qu&#39;il était prudent de répéter le dosage si la variabilité est élevée. Un plasma du patient (concentration finale de 2%) a été testé avant et après que le patient a été traité avec des médicaments. Il a été conclu que, dans ce médicament aux patients ont eu un impact négatif sur la capacité du plasma à soutenir l&#39;efflux de cholestérol. Un autre exemple d&#39;un résultat de l&#39;expérience efflux est montré dans la figure. 2. Dans cette expérience, les macrophages RAW 264.7 ont été activés ou non activés par une nuit d&#39;incubation avec un agoniste de LXR TO-901 317 (concentration finale1 umol / L) et l&#39;efflux de cholestérol au même échantillon de plasma humain (2%) a été testé. Il a été conclu que l&#39;activation de l&#39;expression cellulaire des transporteurs ABC avec un agoniste de LXR augmente la capacité des cellules à libérer le cholestérol à l&#39;accepteur extracellulaire. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> Figure 1. Efflux de cholestérol à partir de cellules THP-1 à différents accepteurs. Pourcentage de l&#39;efflux de cholestérol (c.-à-la proportion de cholestérol marqué déplacé à partir de cellules à l&#39;accepteur spécifié) est affiché après la soustraction des valeurs vides. Moyenne ± écart-type de déterminations quadruples, * p &lt;0,05. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> Figure 2. Efflux de cholestérol à partir de RAW 264.7 activée ou non activée avec un agoniste LXR pour le plasma humain. Pourcentage de l&#39;efflux de cholestérol (c.-à-la proportion de cholestérol marqué déplacé à partir de cellules de laaccepteur spécifié) est affiché après la soustraction des valeurs vides. Moyenne ± écart-type de déterminations quadruples, * p &lt;0,001.

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	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque.">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li><li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality.">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

Les auteurs déclarent pas les conflits d&#39;intérêts liés à cette étude.

Le procédé décrit à mesurer efflux de cholestérol est conçu pour mesurer le mouvement du cholestérol des cellules à un accepteur de cholestérol extracellulaire. Il ya plusieurs considérations clés pour la compréhension de cette méthode. L&#39;étiquetage et l&#39;équilibration Dans la méthodologie décrite cholestérol marqué est ajouté au sérum contenant le sérum. Bien que n&#39;ayant jamais étudié en détail, il est supposé que le taux de cho...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs Files cellules </td><td> HeLa </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> Médias complètes </td><td colspan="3"> RPMI - 10% de FCS - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2% </td><td> M199 - 5% de FCS - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 1% - HEPES 2% (1M) - 7% de supplément de croissance endothélial (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% de FCS - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2% </td></tr><tr><td> Milieux exempts de sérum </td><td colspan="3"> RPMI - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2% </td><td> M199 - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 1% - HEPES 2% (1M) - La cellule endothéliale croissance de 7%supplément e (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2% </td></tr><tr><td> Méthode Passage </td><td> 1 x trypsine </td><td> Suspension </td><td> Gratter </td><td colspan="3"> 1 x trypsine </td></tr><tr><td> Ratio Passage </td><td> 03:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 01:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> Activation cellulaire (facultatif) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXR-agoniste - Conc final. 4 uM </td></tr><tr><td> Autres réactifs </td><td></td><td> phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) La différenciation cellulaire - - Conc final. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

La teneur en cholestérol des cellules doit être maintenue dans les limites très étroites, trop ou trop peu de cholestérol dans quelques résultats de cellules dans la perturbation des membranes cellulaires, l&#39;apoptose et nécrose 1. Les cellules peuvent cholestérol source à partir de la synthèse intracellulaire et de lipoprotéines plasmatiques, les deux sources sont suffisantes pour satisfaire pleinement les exigences des cellules pour le cholestérol. Les processus de synthèse du cholestérol et l&#39;absorption sont strictement réglementées et les carences de cholestérol sont de 2 rares. Le taux de cholestérol excessif est de 3 problème le plus courant. À l&#39;exception des hépatocytes et des cellules corticosurrénales degré, les cellules sont incapables de dégrader le cholestérol. Les cellules ont deux options pour réduire leur teneur en cholestérol: pour convertir le cholestérol en esters de cholestérol, une option avec une capacité limitée que la surcharge des cellules avec des esters de cholestérol est également toxique, et l&#39;efflux de cholestérol, une option avec une capacité potentiellement illimitée. Efflux de cholestérol est un specprocessus de l&#39;IFIC qui est réglementée par un certain nombre de transporteurs intracellulaires, comme liaison de l&#39;ATP des protéines transporteur ABC A1 (ABCA1) et G1 (ABCG1) et de type B1 scavenger receptor. L&#39;accepteur naturel de cholestérol dans le plasma est lipoprotéines de haute densité (HDL) et de l&#39;apolipoprotéine AI. Le test d&#39;efflux de cholestérol est conçu pour quantifier le taux de l&#39;efflux de cholestérol à partir de cellules cultivées. Il mesure la capacité des cellules à maintenir efflux de cholestérol et / ou la capacité de plasma accepteurs d&#39;accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le dosage comprend les étapes suivantes. Etape 1: étiquetage cholestérol cellulaire en ajoutant cholestérol marqué à milieu contenant du sérum et incubation avec des cellules de 24-48 h. Cette étape peut être combiné avec le chargement de cellules avec le cholestérol. Étape 2: l&#39;incubation des cellules dans un milieu sans sérum pour équilibrer le cholestérol marqué parmi tous les bassins cholestérol intracellulaire. Cette étape peut être combiné avec l&#39;activation de cellules chtransporteurs olesterol. Étape 3: l&#39;incubation des cellules avec l&#39;accepteur extracellulaire et la quantification du mouvement du cholestérol marqué à partir de cellules à l&#39;accepteur. Si précurseurs du cholestérol ont été utilisés pour étiqueter le taux de cholestérol nouvellement synthétisé, une quatrième étape, la purification du cholestérol, peuvent être nécessaires. Le test fournit les informations suivantes: (i) la façon dont un traitement particulier (une mutation, un knock-down, une surexpression ou un traitement) affecte la capacité de la cellule au cholestérol efflux et (ii) la façon dont la capacité d&#39;accepteurs de plasma à accepter le taux de cholestérol est affecté par une maladie ou d&#39;un traitement. Cette méthode est souvent utilisée dans le contexte de la recherche cardiovasculaire, des troubles métaboliques et neurodégénératives, infectieuses et maladies de la reproduction.

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Cholesterol Efflux Assay

Le dosage du cholestérol est conçu pour quantifier le taux de cholestérol efflux partir de cellules cultivées et la capacité de plasma accepteurs d&#39;accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le test se compose de marquage des cellules avec le cholestérol, l&#39;équilibration du cholestérol entre les pools intracellulaires et la libération de cholestérol à un accepteur extracellulaire.

Essai efflux de cholestérol

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

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29.5K vues.  Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Le dosage du cholestérol est conçu pour quantifier le taux de cholestérol efflux partir de cellules cultivées et la capacité de plasma accepteurs d'accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le test se compose de marquage des cellules avec le cholestérol, l'équilibration du cholestérol entre les pools intracellulaires et la libération de cholestérol à un accepteur extracellulaire.

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Assay Métastases expérimentales

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In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
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contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Un modèle murin de l&#39;Assay Pocket cornée pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</emTest&gt; Tester la perméabilité des vaisseaux sanguins

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Le<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Simulation pancréatique neuroplasticité:<em&gt; In Vitro</em&gt; Double-neurone Plasticité Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Effets différentiels des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.