Diese Arbeit wurde durch Fördermittel National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526615 und 545906) und zum Teil durch die Regierung von Victoria die OIS-Programm unterstützt. DS ist ein Fellow der NHMRC.

1. Herstellung von [3 H]-Cholesterin <ol><li> In der Dunstabzug, verzichten die erforderliche Menge an [3 H] Cholesterin in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 uCi (19 kBq) pro Vertiefung ist für einen typischen Test erforderlich). </li><li> Wenn [3H]-Cholesterin in Toluol suspendiert wird, trocknen Sie ihn nach unten komplett mit N2-Gas-und resuspendieren mit 100% Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 1 uCi (37 kBq / ul. Vortex und gut mischen. </li></ol> 2. Plattieren von Zellen und Kennzeichnung zellulärem Cholesterin Dieses Protokoll wurde getestet mit folgenden Zelltypen: menschliche Monozyten 4,5, THP-1-menschlichen Monozyten-Makrophagen 6,7,8, RAW 264.7 murine Makrophagen 5,9,10,11, HeLa-Zellen 12, HUVEC (HUVEC), BHK-21 Zellen 9, Human-und Maus-Fibroblasten 13,14, HepG2 menschlichen Hepatokarzinomzellen 15 und, in modifizierter Form, von Thrombozyten &lt;sup&gt; 16. <ol><li> Die Zellen und zähle sie. Tafel Zellen in 12-Well-Platten bei der Enddichte von 0.2x10 6 Zellen pro Well in 0,9 ml Vollmedium. Die Zellen werden weiter wachsen und 0.8x10 6 Zellen pro Well zu dem Zeitpunkt der Ausströmung Experiment erreicht. Für Zellen, die sich nicht teilen, wie differenzierte THP-1 Zellen, sollte die Aussaatdichte 0.8x10 6 Zellen pro Vertiefung sein. Bei Verwendung von 6 - oder 24-Well-Platten, doppelt oder halb so viele Zellen pro Well. Die Zahl der Brunnen sollte ausreichend sein für Vierfachbestimmungen Für jeden experimentellen Zustand. </li><li> Wenn die Differenzierung von THP-1-Zellen erforderlich ist, fügen PMA (Endkonzentration 0,1 g / ml) zu den Medien für 48-72 h. </li><li> Fügen Sie eine kleine Teilmenge von Medien in das Mikrozentrifugenröhrchen mit der [3 H] Cholesterin. </li><li> Waschen Seiten der Röhre mit Medien vor dem Hinzufügen [3 H] Cholesterin in einen separaten Aliquot komplette Medien (100 ul / Well). </li> &lt;li&gt; In der Medien, die [3 H]-Cholesterin in die Vertiefungen mit Zellen (Endvolumen pro Well 1 ml). Wenn keine Behandlung der Zellen vor der Markierung erforderlich ist, können Zellen in [3 H]-Cholesterin-Medium ausplattiert werden. </li><li> Inkubieren Zellen für 48 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 3. Äquilibrierung Incubation <ol><li> Nach 48 Stunden Inkubation, überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, sie sind gesund und sind bei etwa 80% Konfluenz. </li><li> Entfernen Sie das Medium mit [3 H] Cholesterin. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. Wiederholen Sie 3 mal Waschen. </li><li> Bereiten serumfreien Medien. Falls erforderlich, aktivieren Zellen durch Zugabe von LXR-Agonisten (z. B. TO-901317 bei 1-4 mmol / l) oder cAMP (0,3 mmol / l; für Zellen der Maus Ursprungs) zu serumfreien-Medien. </li><li> Fügen Sie 500 ul serumfreiem Medium in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren für 18 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Cholesterin Efflux Incubation <ol><li> Nach 18 Stunden Inkubation in Serum-freiem Medium, zu überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sie gesund sind und konfluent (mindestens 80% Konfluenz). </li><li> Planen Lösung von Cholesterin Efflux Akzeptoren in serumfreiem Medium. Beispiele für Akzeptoren schließen ein: Apolipoprotein AI (ApoA-I) (Endkonzentration 10 ug / ml) High Density Lipoprotein (HDL) (Endkonzentration 20 ug / ml) Cyclodextrin (Endkonzentration 200 ug / ml) Plasma (Endkonzentration 1-2%) </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. </li><li> Fügen Sie 250 ul serumfreiem Medium mit Akzeptoren in jede Vertiefung. </li><li> Lassen Sie eine Reihe von Brunnen, um Hintergrund-Efflux (Ausstrom zu serumfreien Medien ohne Akzeptor) bestimmen </li><li> Inkubieren Zellen für 2 Stunden in der Zellkultur Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Dauer der Inkubation kann Efflux von 30 min bis 8 h variieren, wenn erforderlich. </li></ol> 5. Processing SAmples <ol><li> Nach 2 Stunden Inkubation überprüfen Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Sammeln Sie Medien in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 14.000 rpm für 1-10 min bei Raumtemperatur, um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie 100 ul Medium in 7 ml Szintillations-Fläschchen. In 5 ml Insta-Gel Plus (PerkinElmer) und Vortex-Mischung. Bewahren restlichen Proben bei 4 ° C </li><li> Platzieren Sie Platten in Gefrierschrank für 30 Minuten. Fügen Sie 500 ul dH 2 O in jede Vertiefung. Prüfen Zellen unter dem Mikroskop zu gewährleisten, dass alle Zellen von der Unterseite der Vertiefungen angehoben. Wenn noch anhaftenden, entweder die Platten mit dH 2 O bei 4 ° C über Nacht oder Kratzen Brunnen. </li><li> Wenn alle Zellen aufgehoben wurden ausgeschaltet, und Abpipettieren zum Aufbrechen Zellklumpen. Übertragen Sie 100 ul in 7 ml Szintillationsgefäße. In 5 ml Insta-Gel Plus (PerkinElmer) und Vortex-Mischung. Bewahren restlichen Platten bei 4 ° C </li><li> Platzieren Sie Szintillationsgefäße auf Szintillationszähler. Konfigurieren Zähler für [3 H] zählen indpm Einheiten. </li></ol> 6. Die Analyse der Ergebnisse <ol><li> Die Rate der Cholesterin-Efflux in der Regel als ein Anteil von Cholesterin aus den Zellen verschoben auf den Akzeptor ausgedrückt. Die folgende Formel verwendet wird: </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Die spezifische Abgabe erfolgt als eine Differenz zwischen den Ausfluß in Gegenwart oder Abwesenheit des Akzeptors (leer) berechnet. </li></ol><img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7. Timeline <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für ein Ergebnis einer Cholesterin-Efflux Versuchs ist in gezeigt. 1. In diesem Experiment THP-1 Monozyten wurden in Makrophagen und Cholesterin Efflux auf verschiedene Akzeptoren differenziert wargetestet. Cholesterin Efflux um Medium ohne Akzeptoren (&quot;blank&quot;) betrug 0,79% und dieser Wert wurde als nicht-spezifische Efflux angesehen und von anderen Werten abgezogen. Cholesterin Efflux für die menschliche ApoA-I (Endkonzentration 30 ug / ml) war 4,75%. Ein Verweis Plasmaprobe wurde in diesem Experiment aufgenommen, um inter-experimentellen Variabilität überwachen. Eine Referenzprobe kann für die Normalisierung der Daten über eine große Anzahl von Experimenten verwendet werden, aber wir fanden es sinnvoll, den Test wiederholen, wenn die Variabilität ist hoch. Ein Patient Plasma (Endkonzentration 2%) wurde getestet, bevor und nachdem der Patient mit Medikamenten behandelt wurde. Es wurde gefolgert, dass bei diesem Patienten Medikamente hatten einen negativen Einfluss auf die Kapazität des Plasma-Cholesterin-Efflux zu unterstützen. Ein weiteres Beispiel für ein Ergebnis des Experiments ist in Efflux gezeigt. 2. In diesem Experiment wurden Makrophagen-RAW 264.7 aktiviert oder nicht aktiviert durch Inkubation über Nacht mit LXR-Agonisten TO-901.317 (Endkonzentration1 mol / L) und Cholesterin Efflux zu der gleichen Probe von menschlichem Plasma (2%) wurde getestet. Es wurde festgestellt, dass die Aktivierung der zellulären Expression von ABC-Transportern mit LXR-Agonisten die Fähigkeit von Zellen, Cholesterin zu extrazellulären Akzeptor freizugeben erhöht. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> Abbildung 1. Cholesterin Efflux aus THP-1 Zellen auf verschiedene Akzeptoren. Anteil von Cholesterin Efflux (dh der Anteil der markierten Cholesterin aus den Zellen bewegt, um die angegebene Akzeptor) nach Abzug des Rohlings Werte beschränkt. Mittelwert ± Standardabweichung von Vierfachbestimmungen, * p &lt;0,05. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> Abbildung 2. Cholesterin Ausfluß aus RAW 264.7 aktiviert oder nicht aktiviert mit LXR-Agonisten an menschlichem Plasma. Anteil von Cholesterin Efflux (dh der Anteil der markierten Cholesterin aus den Zellen bewegt, um dieangegeben Akzeptor) wird nach Abzug der Blindwerte gezeigt. Mittelwert ± SD von Vierfachbestimmungen, * p &lt;0,001.

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	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque.">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li><li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality.">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine widerstreitenden Interessen im Zusammenhang mit dieser Studie.

Das beschriebene Verfahren zur Cholesterin-Efflux gemessen wurde entwickelt, um die Bewegung von Cholesterin aus den Zellen zu einer extrazellulären Cholesterin-Akzeptor zu messen. Es gibt einige kritische Überlegungen zum Verständnis dieser Methode. Kennzeichnung und Äquilibrierung In der beschriebenen Methode markierten Cholesterin im Serum enthaltenden Serum zugegeben. Obwohl dies nicht im Detail untersucht, wird angenommen, dass Cholesterin in Serum-Lipoprot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien \ Cells </td><td> HeLa </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> Komplette Medien </td><td colspan="3"> RPMI - 10% FCS - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td><td> M199 - 5% FCS - 1% L-Glutamin - 1% Pen Strep - 2% HEPES (1M) - 7% Endothelzellwachstum Ergänzung (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% FCS - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td></tr><tr><td> Serum-freie Medien </td><td colspan="3"> RPMI - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td><td> M199 - 1% L-Glutamin - 1% Pen Strep - 2% HEPES (1M) - 7% Endothelzellen wachsenth Ergänzung (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% L-Glutamin - 0,2% Pen Strep </td></tr><tr><td> Passage-Methode </td><td> 1 x Trypsin </td><td> Aufhängung </td><td> Schaben </td><td colspan="3"> 1 x Trypsin </td></tr><tr><td> Durchtrittsverhältnis </td><td> 03.10 </td><td> 01.03 </td><td></td><td> 01.20 </td><td> 01.03 </td><td> 01.03 </td></tr><tr><td> Zell-Aktivierung (optional) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901.317 - LXR-Agonisten - Final konz. 4 uM </td></tr><tr><td> Andere Reagenzien </td><td></td><td> Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) - Zelldifferenzierung - Final konz. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

Cholesteringehalt von Zellen innerhalb der sehr engen Grenzen gehalten werden, zu viel oder zu wenig Cholesterin in einer Zelle führt zu Störungen von Zellmembranen, Apoptose und Nekrose 1. Die Zellen können Quelle Cholesterin aus intrazellulären Synthese und von Plasma-Lipoproteine ​​sind beide Quellen ausreichend, um Zellen vollständig erfüllen die Anforderungen für Cholesterin. Die Prozesse der Cholesterin-Synthese und die Aufnahme ist streng reguliert und Mängel an Cholesterin sind selten zwei. Übermäßige Cholesterin ist häufiger Problem 3. Mit Ausnahme von Hepatozyten und in gewissem Maße NNR-Zellen, Zellen sind nicht in der Lage, Cholesterin zu degradieren. Die Zellen haben zwei Möglichkeiten, um ihre Cholesterin-Gehalt zu reduzieren: auf Cholesterin in Cholesterylester, eine Option mit begrenzten Kapazitäten zu konvertieren, wie eine Überlastung Zellen mit Cholesterylestern ist auch giftig, und Cholesterin Efflux, eine Option, mit potenziell unbegrenzte Kapazität. Cholesterin Efflux ist ein specific Prozess, der durch eine Reihe von intrazelluläre, wie ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Proteine ​​A1 (ABCA1) und G1 (ABCG1) und Scavenger-Rezeptor des Typs B1 reguliert wird. Die natürliche Akzeptor von Cholesterin im Plasma ist High Density Lipoprotein (HDL) und Apolipoprotein AI. Die Cholesterin-Efflux Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen zu quantifizieren. Es misst die Fähigkeit von Zellen, Cholesterin Efflux und / oder die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu halten. Der Assay besteht aus den folgenden Schritten. Schritt 1: Markieren zellulärem Cholesterin mit indem markiertem Cholesterin im Serum enthaltenden Medium und Inkubation mit Zellen für 24-48 h. Dieser Schritt kann mit dem Laden der Zellen mit Cholesterin kombiniert werden. Schritt 2: Inkubation der Zellen in einem Serum-freien Medium auf markiertem Cholesterin unter allen intrazellulären Cholesterin-Pools sich ausgleichen lassen. Dieses Stadium kann mit der Aktivierung von zellulären ch kombiniert werdenolesterol Transporter. Schritt 3: Inkubation der Zellen mit der extrazellulären Akzeptor und Quantifizierung der Bewegung des markierten Zellen Cholesterin aus dem Akzeptor. Wenn Cholesterin Vorstufen wurden verwendet, um neu synthetisierte Cholesterin zu kennzeichnen, einen vierten Schritt, Reinigung von Cholesterin, erforderlich sein. Der Test liefert folgende Informationen: (i), wie eine bestimmte Behandlung (eine Mutation, eine Knock-down, eine Überexpression oder eine Behandlung) die Kapazität der Zelle wirkt sich auf Efflux Cholesterin und (ii), wie die Kapazität des Plasma-Cholesterin-Akzeptoren zu akzeptieren durch eine Krankheit oder eine Behandlung beeinflusst. Diese Methode wird häufig in Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Forschung, metabolische und neurodegenerative Erkrankungen, Infektionskrankheiten und reproduktiven Erkrankungen eingesetzt.

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Cholesterol Efflux Assay | Medicine | Video

Cholesterol Efflux Assay

Die Cholesterin-Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen und die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu quantifizieren. Der Test besteht aus Markieren von Zellen mit Cholesterin, Äquilibrierung von Cholesterin unter den intrazellulären Pools und Freisetzung von Cholesterol an einer extrazellulären Akzeptor.

Cholesterin Efflux-Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

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29.5K Aufrufe.  Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Die Cholesterin-Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen und die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu quantifizieren. Der Test besteht aus Markieren von Zellen mit Cholesterin, Äquilibrierung von Cholesterin unter den intrazellulären Pools und Freisetzung von Cholesterol an einer extrazellulären Akzeptor.

Serie: Cholesterol Efflux Assay

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Forschung

Medizin

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Ein Maus-Modell der Cornea Pocket-Assay für die Angiogenese-Studie

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Die<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität:<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zwei-Neuron-Plastizität Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.