L’hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Nos protocoles fournissent des outils précieux pour étudier les conséquences physiologiques et mécanistes de l’hypercholestérolémie. Ces procédures peuvent être effectuées à l’aide de l’équipement de laboratoire de base, et sont applicables aux cellules, tissus et ovocytes Xenopus.
Le cholestérol est un composant majeur des membranes cellulaires dans tout le corps. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans n’importe quel type de cellule. Disséquer les artères est l’étape la plus difficile.
Retirez soigneusement l’artère du cerveau, sans étirer ni endommager le tissu vasculaire. Les lipides sont très délicats, et travailler avec eux est plus un art qu’une science. Démonstration vidéo fournit un guide pour apprendre à gérer les lipides avec soin.
Pour préparer la solution de méthyl-bêta-cyclodextrine saturée de cholestérol, ajoutez d’abord 064 grammes de méthyl-bêta-cyclodextrine à 10 millilitres de PBS, en remuant la solution avec une barre de remue-remuer, pour s’assurer que la méthyl-bêta-cyclodextrine se dissout complètement. Ensuite, ajouter 0024 grammes de poudre de cholestérol à la fiole, et remuer la solution vigoureusement, à l’aide d’une spatule pour briser autant de morceaux de cholestérol que possible. Lorsque presque tout le cholestérol a été dissous, sceller le flacon avec au moins deux couches de film de paraffine.
Et secouez le flacon à environ 30 oscillations par minute dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après huit à 16 heures, refroidir la solution à température ambiante, avant de filtrer le mélange à travers un filtre à seringue polyethersulfone de 22 micromètres dans une bouteille de classe. Pour l’enrichissement de l’artère cérébrale des mammifères, récolter le cerveau d’un rat Sprague Dawley de 250 à 300 grammes dans un bécher de PBS sur la glace, avant de transférer le cerveau dans un bol de dissection ciré, sous un microscope dissection, contenant juste assez de PBS pour submerger le tissu.
Fixez le cerveau avec deux à trois broches, en vous assurant qu’ils ne pénètrent pas dans les vaisseaux sanguins. Et utilisez des forceps pointus et de petits ciseaux chirurgicaux pour disséquer doucement les artères cérébrales et leurs branches qui forment le Cercle de Willis à la base du cerveau. Ensuite, rincez brièvement jusqu’à un centimètre de long segments d’artère dans PBS, avant d’incuber les segments rincés dans suffisamment de cholestérol solution enrichissante pour couvrir les tissus.
Pour déterminer toute altération du taux de cholestérol, utilisez une bouteille fraîche de poudre de filipin pour préparer une solution de bouillon de 10 milligrammes par millilitre du colorant dans du sulfoxyde de diméthyle, et lavez les tissus enrichis en cholestérol avec trois lavages de cinq minutes dans du PBS frais. Après le dernier lavage, fixer les segments d’artère en 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes sur la glace, à l’abri de la lumière, avant de perméabiliser les échantillons dans 5%Triton en PBS pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les tissus avec trois lavages de cinq minutes en PBS sur un shaker, avant d’ajouter les échantillons à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre de solution de colorant filipin, pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.
À la fin de l’incubation, laver les œuvres de l’artère trois fois comme démontré, suivie d’un bref rinçage à l’eau distillée. Après le dernier lavage, utilisez un tissu de laboratoire pour absorber tout excès de liquide et montez les artères sur une lame à l’aide d’un support de montage approprié. Couvrez soigneusement les artères d’un glissement de couvercle, en prenant soin d’éviter de rouler ou de tordre le tissu, et laissez sécher la glissade pendant 24 heures à température ambiante, à l’abri de la lumière.
Lorsque le milieu de montage est sec, sceller les bords de glissement de couverture avec du vernis à ongles clair, et laisser sécher le vernis pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, imagez le tissu avec une excitation de 340 à 380 nanomètres, et une émission de 385 à 470 nanomètres. Pour préparer la dispersion à base de phospholipide, combinez 200 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de solution lipidique dissoute chloroforme, L-alpha-phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, et cholestérol dans un tube de verre de 12 millilitres.
Évaporer le chloroforme dans le capot sous un flux d’azote, avant de suspendre les lipides dans 800 microlitres de chlorure de potassium tamponné de 150 millimlaires et de 10 millimlaires tris HEPES solution. Ensuite, sceller le tube avec du film de paraffine, et sonifier doucement le contenu du tube à 80 kilohertz pendant 10 minutes, jusqu’à ce qu’un mélange laitier soit formé. Pour l’enrichissement en cholestérol des ovocytes Xenopus, utilisez des forceps tranchants pour perturber le sac ovarien d’une grenouille femelle Xenopus laevis dans plusieurs régions, et placez les morceaux d’ovaire dans une plaque de 60 millimètres avec cinq millilitres de ND96 sans calcium complétés par 5 milligrammes par millilitre de collagène.
Secouez le tissu sur un shaker orbital à 60 oscillations par minute pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, utiliser une pipette de transfert avec une pointe large pour pipette vigoureusement l’ovocyte contenant la solution cinq à dix fois pour isoler les ovocytes individuels, et rincer rapidement la solution d’ovocyte foncé avec nd96 frais sans calcium jusqu’à ce que la solution devienne transparente. Ensuite, transférez 90 microlitres de la dispersion à base de phospholipide enrichie en cholestérol dans un puits d’une plaque de puits de 96, et ajoutez jusqu’à six ovocytes au puits avec le moins de milieu possible.
Placez la plaque de puits 96 sur un rotateur de plate-forme tridimensionnel pendant cinq à dix minutes. Ajoutez ensuite une goutte de ND96 au puits et transférez les ovocytes enrichis en cholestérol dans une plaque de 35 millimètres contenant du ND96 pour leur analyse immédiate. Ici, un exemple d’une couche lisse d’artère cérébrale imaged démontre l’augmentation dépendante de concentration de fluorescence associée de filipin obtenue sur l’enrichissement de tissu avec des concentrations croissantes de cholestérol.
Notamment trois heures après le traitement par le complexe de cholestérol méthylique-bêta-cyclodextrine, les taux de cholestérol ont diminué d’environ 50% par rapport à leur niveau immédiatement après l’enrichissement. Tandis qu’un temps d’incubation d’une heure est couramment employé pour enrichir les tissus et les cellules avec le cholestérol pendant cette approche, cinq minutes d’incubation sont habituellement suffisantes pour réaliser une augmentation statistiquement significative de la teneur en cholestérol artérielle cérébral telle que déterminée par l’essai biochimique basé sur l’oxidase de cholestérol. Bien qu’aucun changement significatif ne soit observé dans les niveaux de cholestérol dans les ovocytes Xenopus enrichis de dispersions à base de phospholipide de contrôle manquant de cholestérol, les niveaux de cholestérol augmentent de manière significative après seulement cinq minutes de traitement avec les dispersions à base de phospholipide qui incluent le cholestérol, et restent à ce niveau lorsque le temps d’incubation est augmenté à 60 minutes.
L’efficacité de l’approche basée sur la cyclodextrine pour enrichir les cellules est également démontrée chez les neurones fraîchement isolés de la région CA1 de l’hippocampe. En effet, l’incubation des neurones dans le méthyl-bêta-cyclodextrine saturé de cholestérol pendant 60 minutes entraîne une augmentation de plus de deux fois du taux de cholestérol, tel qu’évalué par la fluorescence associée aux filipins. Dans l’ensemble, les deux étapes les plus importantes pour ces procédures sont la préparation du mélange d’enrichissement du cholestérol et d’assurer l’intégrité du tissu artérielle.
Après l’enrichissement du cholestérol, on peut étudier la fonction des protéines qui sont affectées par l’hypercholestérolémie. La capacité d’enrichir les cellules avec le cholestérol a facilité l’étude des niveaux élevés de cholestérol dans les cardiomyocytes et les neurones. L’utilisation d’ovocytes nous a permis d’étudier comment le cholestérol se lie aux canaux irionaux.
Un manteau de laboratoire et des gants qu’elle porte toujours pour ce protocole. Le chloroforme et le paraformaldéhyde doivent être utilisés sous un capot de fumée et être jetés comme déchets dangereux.
