この作品は、ビクトリア州政府のOIS​​プログラムによる国民健康、オーストラリアの医学研究評議会（NHMRC）（526615と545906）から、一部の補助金によって支えられている。 DSはNHMRCの仲間です。

1。 [3 H] -コレステロールの調製<ol><li>ドラフトでは、1.5ミリリットル遠心チューブ（0.5ウェル当たりμCiの（19放射能）が典型的なアッセイのために必要とされる）に[3 H]コレステロールの必要量を分注する。 </li><li> [3 H] -コレステロールをトルエン中に懸濁されている場合は、同様に1μCi（37放射能/μL。ボルテックスし、ミックスの最終濃度の100％エタノールのN2ガスを再懸濁して完全にそれを乾燥させてください。 </li></ol> 2。メッキ細胞およびラベリング細胞コレステロールヒト単球4,5、THP-1ヒト単球-マクロファージ6,7,8、RAW 264.7マウスマクロファージ5,9,10,11、HeLa細胞12、内皮細胞、ヒト臍帯静脈：このプロトコルは、次のセルタイプを使用してテストされています血小板由来の細胞（HUVEC）、BHK-21細胞9、ヒトとマウスの線維芽細胞13,14、HepG2細胞、ヒト肝癌細胞15と、修正された形で、&lt;&gt; 16のsup。 <ol><li>細胞を再懸濁し、それらをカウントします。 0.9ミリリットルの完全培地でウェルあたり0.2x10 6個の細胞の最終濃度で12ウェルプレートに細胞をプレート。細胞が成長し続け、流出実験の時間帯によって、ウェルあたり0.8×10 6個の細胞に到達します。そのような分化したTHP-1細胞として分裂しない細胞については、播種密度は、ウェルあたり0.8×10 6個の細胞である必要があります。それぞれ、24ウェルプレート、ダブルまたはウェルあたりの細胞数の半分 - 6を使用している場合。井戸の数は、各実験条件のために四重決定のための十分なはずです。 </li><li> THP-1細胞の分化が必要な場合は、48〜72時間のためにメディアにPMA（最終濃度0.1μg/ ml）を追加します。 </li><li> [3 H]コレステロールを含むマイクロチューブにメディアの小アリコートを追加します。 </li><li>完全なメディアの別のアリコート（100μl/ウェル）に[3 H] のコレステロールを添加する前にメディアでチューブの側面を洗ってください。 </li> &lt;LI&gt;細胞（ウェルあたり最終容量が1 mlである）で各ウェルに[3 H]コレステロールを含むメディアを追加します。細胞のない治療がラベリングの前に必要でない場合、細胞は、[3 H]コレステロール含有培地に播種することができます。 </li><li>細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で48時間細胞をインキュベートします。 </li></ol> 3。平衡インキュベーション<ol><li> 48時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは健康であり、約80％コンフルエントであることを確認してください。 </li><li> [3 H]コレステロールを含むメディアを削除します。 PBSで穏やかに細胞を洗浄します。 3洗浄回数を繰り返します。 </li><li>無血清培地を準備します。血清フリー培地に、必要な場合には、LXRアゴニスト（例えば、1から4 mmol / lの時TO-901317など）やcAMPを（唯一のマウス由来の細胞を0.3モル/ l）を添加することにより細胞を活性化する。 </li><li>各ウェルに500μlの無血清培地を追加します。 </li><li> （37℃、5％CO 2）細胞培養インキュベーター中で18時間インキュベートする。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。コレステロール流出インキュベーション<ol><li>無血清培地で18時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは（最低80％のコンフルエンシー）健康とコンフルエントであることを確認します。 </li><li>無血清培地中のコレステロール流出受容体の溶液を調製します。受容体の例は次のとおりです。 アポリポタンパク質AI（アポA-I）（最終濃度10μg/ ml）を 高密度リポタンパク質（HDL）（最終濃度20μg/ ml）を シクロデキストリン（最終濃度200μg/ ml）を 血漿（最終濃度1-2％） </li><li> PBSで穏やかに細胞を洗浄します。 </li><li>各ウェルにアクセプターと無血清培地250μlを添加します。 </li><li>背景の流出を（NOアクセプターと無血清培地への流出）を決定するために井戸のセットを1つ残す</li><li>細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で2時間細胞をインキュベートします。必要に応じて流出インキュベーションの持続時間は30分〜8時間と異なる場合があります。 </li></ol> 5。処理土mples <ol><li> 2時間インキュベートした後、顕微鏡で細胞を確認してください。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブにメディアを収集します。細胞の残骸を削除するには、室温で1から10分間14,000 rpmでスピン。 </li><li> 7mlのシンチレーションバイアルに100μlのメディアを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で、残りのサンプルを保存</li><li> 30分のために冷凍庫にプレートを置きます。各ウェルに500μlのdH 2 Oを追加します。すべての細胞がウェルの底から持ち上げていることを確認し顕微鏡下で細胞を確認してください。まだ付着した場合、4℃で一晩またはこすっ井戸でdH 2 Oでプレートを残してどちらか。 </li><li>すべてのセルがリフトオフした後、細胞塊を分割するために上下にピペッティングします。 7mlのシンチレーションバイアルに100μLを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で残りのプレートを保存</li><li>シンチレーションカウンターでシンチレーションバイアルを置きます。 [3 H]のカウントでカウンタの構成DPMユニット。 </li></ol> 6。結果を分析する<ol><li>コレステロール流出の速度は通常アクセプターへの細胞から移動したコレステロールの割合として表されます。次の式が使用されます。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2"><li>特定の流出は、受容体の存在下または非存在下（ブランク）の流出の差として計算されます。 </li></ol><img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7。タイムライン<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8。代表的な結果コレステロール流出実験の結果の例を図に示されています。 1。この実験では、THP-1ヒト単球があった別の受容体にマクロファージやコレステロール流出に分化したテストされています。ないアクセプター（ &quot;空白&quot;）と媒体へのコレステロール流出は0.79％であり、この値は、非特定の流出とみなされ、他の値から差し引いた。人間のアポA-I（終濃度30μg/ mlの）へのコレステロール流出は4.75％であった。リファレンス·血漿サンプルは、間実験の変動を監視するには、この実験に含まれていました。参照サンプルは、実験の多数間でのデータの正規化に使用されるが、我々はばらつきが大きい場合、検定を繰り返すことが賢明見つけることができます。患者は薬で治療した前と後の患者の血漿（最終濃度2％）がテストされています。それはこの患者の薬のコレステロール流出をサポートするために、プラズマの能力にマイナスの影響を与えたと結論された。 流出実験の結果の別の例を図に示されています。 2。この実験ではRAW 264.7マクロファージはLXRアゴニストTO-901317で一晩インキュベートした（最終濃度によって活性化または活性化されていない1μmol/ Lの）およびヒト血漿の同じサンプル（2％）へのコレステロール流出を試験した。これは、LXRアゴニストとABCトランスポーターの細胞内発現の活性化が細胞外受容体にコレステロールを解放するためにセルの容量を増加させると結論された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> 図1。様々なアクセプターへのTHP-1細胞からのコレステロール流出。コレステロール流出の割合は、（すなわち、標識されたコレステロールの割合は、細胞から指定されたアクセプターに移動）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P &lt;0.05。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> 図2。コレステロール流出のRAW 264.7ヒト血漿にLXRアゴニストにより活性化または有効になっていません。割合（すなわち、標識コレステロールの割合からのコレステロール流出は細胞からに移動指定されたアクセプター）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P &lt;0.001。

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	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. 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Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

著者らは、この研究に関連する一切の利害を宣言しません。

コレステロール流出を測定するために記載した方法は、細胞外コレステロール受容体への細胞からのコレステロールの動きを測定するために設計されています。この方法論を理解する上で、いくつかの重要な考慮事項があります。 ラベルと平衡記載された方法論で標識されたコレステロールは血清含有血清に追加されます。詳細に調べなかったが、そ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬\セル </td><td> HeLa細胞 </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> 完全なメディア </td><td colspan="3"> RPMI - 10％FCS - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td><td> M199 - 5％FCS - 1％L-グルタミン - 1％ペン連鎖球菌 - 2％HEPES（1M） - 7％内皮細胞増殖サプリメント（ECGS） </td><td colspan="2"> DMEM - 10％FCS - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td></tr><tr><td> 無血清培地 </td><td colspan="3"> RPMI - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td><td> M199 - 1％L-グルタミン - 1％ペン連鎖球菌 - 2％HEPES（1M） - 7％内皮細胞の成長目のサプリメント（ECGS） </td><td colspan="2"> DMEM - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td></tr><tr><td> 通過方法 </td><td> 1×トリプシン</td><td>サスペンション</td><td>落とす</td><td colspan="3"> 1×トリプシン</td></tr><tr><td> 通過率 </td><td>午前3時10分</td><td> 1時03分</td><td></td><td> 1時20分</td><td> 1時03分</td><td> 1時03分</td></tr><tr><td> 細胞活性化（オプション） </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXRアゴニスト - ファイナルの濃4μM </td></tr><tr><td> その他の試薬 </td><td></td><td> ホルボール12 -ミリステート13 -アセテート（PMA） - 細胞分化 - ファイナルの濃0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

細胞のコレステロール含有量は、細胞膜の破壊、アポトーシスとネクローシス1のセルの結果に多すぎる、または少なすぎるコレステロール、非常にタイトな限界内に維持する必要があります。細胞は細胞内合成から、血漿リポタンパク質からソースコレステロール、両方のソースは完全にコレステロールの細胞の要件を満たすのに十分であることができます。コレステロール合成と取り込みのプロセスが厳密に制御し、コレステロールの欠点は、2稀であるされています。過剰なコレステロールは、より一般的な問題は3です。肝細胞の例外を除いて、ある程度副腎皮質細胞に、細胞はコレステロールを低下させることができません。細胞は、そのコレステロール含有量を削減するための2つのオプションがあります。も有毒であるコレステリルエステルで細胞をオーバーロードとしてコレステリルエステル、限られた容量を持つオプションにコレステロール値を変換し、コレステロール流出、潜在的に無限の容量を持つオプションに。コレステロール流出は仕様です。このようなATP結合カセットトランスポータータンパク質A1（ABCA1）とG1（ABCG1）とスカベンジャー受容体タイプのB1の細胞内輸送、数によって規制されてIFICプロセス。血漿中のコレステロールの自然な受容体は高密度リポタンパク質（HDL）およびアポリポタンパク質AIです。 コレステロール流出のアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出の割合を定量化するために設計されています。それはコレステロール流出および/または細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を維持するために、セルの容量を測定します。アッセイは、次の手順で構成されます。ステップ1：血清含有培地に標識コレステロールを添加し、24〜48時間のために細胞とインキュベートすることにより、細胞のコレステロールをラベリング。この手順は、コレステロールの細胞のローディングと組み合わせることができる。ステップ2：すべての細胞内コレステロールプール間で標識されたコレステロールを平衡化するための無血清培地中の細胞のインキュベーション。この段階は、細胞のchの活性化と組み合わせることができるolesterolトランスポーター。ステップ3：細胞外受容体や細胞から受容体への標識コレステロールの動きの定量と細胞のインキュベーション。コレステロールの前駆体は、新たに合成されたコレステロールを標識するために使用された場合、第四ステップは、コレステロールの精製は、必要な場合があります。 特定の治療（突然変異、ノックダウン、過剰発現または治療）が流出コレステロール、および（ii）プラズマアクセプターの容量がコレステロールを受け付ける方法に、セルの容量をどのように影響するか（I）：アッセイは、以下の情報を提供します病気や治療の影響を受けています。このメソッドは、しばしば心血管研究、代謝および神経変性疾患、感染症と生殖疾患のコンテキストで使用されます。

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Cholesterol Efflux Assay | Medicine | Video

Cholesterol Efflux Assay

コレステロールアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出率と細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を定量化するために設計されています。アッセイは、細胞内プールと細胞外受容体へのコレステロールのリリース間でのコレステロールコレステロール、平衡で細胞を標識で構成されています。

コレステロール流出アッセイ

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

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29.5K ビュー.  Baker IDI Heart and Diabetes Institute. コレステロールアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出率と細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を定量化するために設計されています。アッセイは、細胞内プールと細胞外受容体へのコレステロールのリリース間でのコレステロールコレステロール、平衡で細胞を標識で構成されています。

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

実験的転移アッセイ

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

医学

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

ビボ犬筋肉の機能アッセイに

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

血管新生研究のための角膜ポケットアッセイのマウスモデル

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

ザ<em&gt;卵で</em肉腫のためXenograftmodelとして&gt; CAMアッセイ

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

膵神経可塑性をシミュレートする。<em&gt;体外</em&gt;デュアルニューロンの可塑性アッセイ

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.