1. 세포 분리 <ol><li> 표시되는 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1입니다. 이 프로토콜에 걸쳐 사용되는 특정 시약의 카탈로그 번호를 보려면 표 1을 참조하십시오. PBS 목욕의 망막 해부. 해부 동안, 그것은 망막이 분리에 방해가 있습니다 그들을 지키는 이후 유리체와 렌즈를 제거하는 것이 가장 좋습니다. 이것은 망막 색소 상피 (RPE)를 모두 제거하고 어떤 경우에 완전히 그것을 제거하는 것은 불가능 수 있습니다 항상 매우 중요하지 않습니다. 그러나 photoreceptors의 단일 세포 프로 파일링 실험, RPE은 제거되어야합니다. RPE를 제거하지 않으면 RPE 표현된 유전자와로드 셀 프로필 오염으로 이어질 수 있습니다. 이것은 아마도 photoreceptors와 RPE 사이의 연결에 의한 것입니다. 분리의 경우 전체 성인 murine 망막는 20를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 10 분 동안 37 ° C에서 incubated있다μl 활성화된 papain, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 20 μl 25 밀리미터 시스테인, 그리고 360 μl 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS가) 10 MM HEPES와 보충. 필터 - 스쳐 피펫 팁은 잠재적인 오염을 최소화하기위한 프로토콜의 모든 단계에 사용됩니다. papain 농도과 부화의 시간은 연령과 조직의 특성에 따라 달라집니다. 예를 들어 출생 후의 일 0 (P0)에서 격리 망막을 개발 해리 위해, 10 μl 활성 papain, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 μl 25 밀리미터 시스테인 및 10 밀리미터 HEPES과 보충 380 μl 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 망막을 품어 37 ° C. 10 분 여러 종의 망막은 또한 약간 다른 조건이 필요합니다. 치킨 망막 개발의 대부분 단계에 마우스 망막보다 얇은 있습니다. 10 μl 활성화된 papain, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 μl 25 밀리미터 시스테인, 37시 5 분 10 밀리미터 HEPES과 보충 380 μl 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) ° C를 사용하여 T를 떼어 놓다 충분hese 망막. </li><li> 부드럽게 어떠한 정착 세포를 이동시키다하는 튜브를 누르 다음, P1000 pipettor으로 부드럽게 평균의 10 배에서 20 배를 씹다. 37시 추가로 10 분 동안 품어 ° C에서 조직의 크고 대단히 짧은 시간이 평균의 10 배에서 20 배를를 지속하고 다시 씹다 경우. </li><li> DNase I (10 U / μl) 5 μl을 넣고 실온에서 5 분 동안 품어. P1000 pipettor으로 부드럽게 가루로 빻다. 시간의 정확한 숫자는 경험적으로 판단해야하지만, 일반적으로 10-20 사이에 떨어지는 것입니다. </li><li> 3 분위한 3,000 rpm으로 테이블 탑 원심 분리기에서 원심 분리기 하단에 액체 100-200 μl를 떠나, 표면에 뜨는을 제거하고 펠릿 꺼내려 튜브를 누릅니다. HBSS 1 ML을 추가하고 부드러운 분쇄와 펠렛을 resuspend. 튜브를 대는 건 단순히 망막 세포의 많은 lyse와 펠렛을 resuspending 여기있는 것이 중요합니다. 이것은 성인 murine 망막과 특히 그렇습니다. </li><li> 3 분위한 3,000 rpm으로 원심 조심스럽게 포함하는 PBS의 450 μl에 뜨는 및 resuspend를 제거ING 0.1 % BSA. 그것은 미래에 반응을 억제 수도 분리의 lysed 세포 및 기타 제품에서 mRNAs의 존재를 최소화하기 위해 가능한 한 많이 뜨는의를 제거하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. 단일 세포를 수확 <ol><li> 0.1 % BSA와 보충 PBS의 5 ML 담긴 두개 6cm 요리를 준비합니다. 플레이트는 dissociated 한 접시 진입 세포와 세포가 적어도 5 분 동안 정착하실 수 있습니다. 사용되는 셀 밀도는 프로필에 단일 세포의 특성에 크게 의존합니다. 예를 들어, 형광 마커와 같은 GFP와 라​​벨이 매우 드문 세포에 대해, 전체 dissociated 망막은 단일 6cm 요리에 도금하고 있습니다. 약간 더 풍부 세포 들어, 적은 수의 세포가 처음보다 쉽게​​ 첫 micropipette 하나의 (혹은 것과 아주 가까운) 전지를 꺼낼 수 있도록 도금있다. </li><li> 거꾸로 현미경에 dissociated 세포의 접시를 놓습니다. 우리는 올림푸스에서 IMT-2 모델을 사용합니다. 좋로 그려진되었습니다 micropipettes 사용함께 흡인기 튜브와 NE 팁 (내경 0.5 mm, 외경 1.04 ㎜) (그림 2)는 단일 세포를 수확. 세포는 쉽게 그것을 접시에 접근해서 배치됩니다 micropipette를 입력합니다. 이것은 흡인기 튜브가 거꾸로 현미경 (우리가 거​​꾸로 현미경과 함께 사용 흡인기 튜브 38.1 cm 오래입니다)과 관련된 무대도 너무 오래하거나 거리가 너무 짧은 것이 중요합니다. 튜브가 너무 긴 경우 세포는 회수 관에 micropipette에서 효율적으로 추방되지 않을 수 있습니다. 우리가 나이가 IMT-2 모델 거꾸로 현미경을 사용하는 주된 이유는 우리가 우리 흡인기 조립 튜브의 무대로 이상적인 거리를 가지고 발견한다는 것입니다. micropipette를 입력한 후 셀 (또는 셀)은 하나 하나의 세포가 유전자 발현 프로 파일링을위한 수확되도록 두 번째 접시 (세척 접시)에 퇴학하고 있습니다. 두 번째 접시에 역시 새로운 micropipette과 관계없는 세포를 제거하는 종종 필요하다혹은 단지 하나의 세포 micropipette를 입력 있도록 다른 위치로 관심 셀을 이동합니다. </li><li> 개별 셀을 완전히 인접 세포로부터 분리되면, 섹션 2.2에서와 같이 관심 셀 대기음하는 새로운 micropipette를 사용하고 4.5 μl 세포 용해 완충액을 포함한 0.2 ML PCR 튜브에 직접 퇴학. 세포는 튜브로 micropipette의 팁을 끊다 않도록주의되는 튜브의 측면에 퇴학하고 있습니다. 샘플은 용해 버퍼에 세포를 담가 위해 벤치 위로 microcentrifuge로 간단히 냈지 수 있습니다. 이 회전은 보통 단세포 고립의 기간 동안 얼음에 보관해야합니다 모든 다섯째 세포 후 다음 다시 용해 버퍼에 단일 세포를 포함하는 collection.Tubes 끝에 이루어집니다. 최적의 결과를 얻으려면 하나의 세포는 두 시간 창 사후 분해 내에 저장됩니다. 이번 경과 후 추가적인 시간이 observ 걸렸고 그것은 반대로 전사 단계로 진행하는 것이 가장 좋습니다에드는 RNA 저하의 가능성을 높일 수 있습니다. </li></ol> 3. 스크립트 작성을 역방향 <ol><li> 간단히 모두 하나의 세포가 세포 용해 완충액에 열중하고 보장하기 위해 benchtop minicentrifuge에서 샘플을 돌리다. 세포 용해를 촉진하기 위해 90 초 동안 70 ° C에서 샘플을 품어. thermocycler 인치 즉시 다시 얼음 튜브를 넣습니다. </li><li> 2 분 동안 얼음 튜브를 남겨주세요. 모든 시약의 첨가의 경우 오염을 방지하기 위해 필터 팁 피펫 팁을 사용합니다. 반대로 전사를 수행하려면 0.33 μl 윗첨자 III (200 U / μl), 0.05 μl RNase 억제제 (40 U / μl) 및 0.07 μl T4 유전자 32 단백질을 추가합니다. 50시 50 분 ° C ~ thermocycler에 대해 반응 혼합물을 품어. 얼음에 15 분 장소 70시 효소 °​​ C를 Inactivate. </li><li> 무료 뇌관을 제거하려면, 0.1 μl Exonuclease 버퍼 (10X), 0.8 μl DH 2 0 (분자 생물학 등급) 및 0.1 μl Exonuclease를 추가 I (20 U / μl). 30 분 동안 37 ° C에서 부화thermocycler. 25 분 동안 80 ° C에서 반응을 잠복기 후 얼음에 튜브를 삽입하여 효소를 Inactivate. </li></ol> 4. PCR을 미행하고 단일 셀 <ol><li> 미행 반응 혼합물 6 μl을 넣고 10 분 동안 20 분, 70 ° C에 대해 37 ° C에서 샘플을 부화 thermocycler를 사용하여, 4 시에 개최 ° C </li><li> PCR 반응 혼합물에 꼬리 시료 10 μl를 추가하고 다음과 같은 조건을 사용하여 두 번째 가닥 합성과 PCR 증폭을 수행합니다 : <ol><li> 2 분 95 ° C </li><li> 5 분에 대해 37 ° C </li><li> 16 분 72 ° C </li><li> 40 초위한 93 ° C </li><li> 1 분에 대해 67 ° C </li><li> 사이클 당 6 초 추가 6 분 72 ° C, </li><li> 4 34 번 단계로 이동 </li><li> 10 분 72 ° C </li><li> 4에서 멈춰 ° C </li></ol></li></ol> 5. Affymetrix 칩 레이블링 <ol><li> cDNA의 라벨 10-20 μg (증폭된 cDNA 결과의 농도단일 세포에서 ING는 일반적으로 Affymetrix의 microarrays에 대한 강력한 하이브 리다이 제이션을 얻기 위해) 1 μg / μl를 낙제야있다. 첫째, 조각 μl 80에 8 μl 1X 원 Phor - 모든 버퍼와 희석 1 μl (1X에서 1시 10분 원 Phor - 모든 버퍼) DNaseI로 단일 셀 cDNA의 10-20 μl를 추가하여 cDNA 반응. 37시 13 분 대한 thermocycler에 품어 ° C. 100 ° C와 얼음의 장소에 15 분 동안 DNase I을 Inactivate. </li><li> 20 μl 5 배 가열 치사 시간 버퍼, 2.5 μl 비오틴 N6-ddATP (엔조 Biosciences), 1 μl 가열 치사 시간을 (가열 치사 시간 버퍼에 1시 8분 희석) 추가합니다. </li><li> 65 후 5 분 ° C., 37 ° C에서 90 분 동안 품어 -20 ° C에서 상점 또는 Affymetrix microarray 즉시 잡종. 하이브 리다이 제이션은 표준 Affymetrix 프로토콜을 사용하여 수행됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 cDNA 샘플의 cDNA, 10 μl의 품질을 평가하는 것은 1 % 아가로 오스 겔에로드되었습니다. cDNA는 주로 (500-2000 BP) 크기의 범위에 의해 규정되는cDNA 비방 및 강도 (그림 1 및 그림 3A). 그림 1에 묘사된 겔에서 다른 모든 차선은 망막 세포로부터 cDNA 얼룩이 E16.5을 분리 보여줍니다. 전용 미디어가 바늘로 aspirated과 PCR 튜브로 입금되면 차선이 사이에 발생하는 얼룩을 보여줍니다. 이러한 차선은 희미한 얼​​룩을 완벽하게 찾아볼 수없는 절대 아니지만 유전자 특정 PCR의 primers가 그들의 유전자를 증폭하는 데 사용되는 때 그들은 어떤 결과를 표시하지 않습니다. 또한 cDNA 비방의 강도는 (그림 1 및 그림 3a를 비교) 다소 다를 수 있습니다. 차선은 B, C, D, 전자 상당히 덜 견고한있는 동안 그림 3A의 차선에서, F, G와 H는 강력한 cDNA 얼룩을 포함합니다. 유전자 특정 PCR은 하나의 세포로부터 cDNA의 품질의 보조 화면으로 사용됩니다. 그림 3의 cDNAs는 형광등 망막 신경절 세포를 격리 그리고 그들은 teste 었죠d는 망막 신경절 세포 마커 Brn3b 및 Pax6위한 PCR의 primers를 사용하여. 이 분석은 cDNA 1 μl 30주기위한 PCR를 받게되었다. 실시간 정량 PCR은 바람직 검정 될하지만 prohibitively 고가이어야하며 단지 cDNA 품질을 평가하기위한 필요하지 않습니다 있습니다. 단일 세포의 모든 8 Pax6 (그림 3B) 8 아웃 Brn3b 및 6에 양성. 심지어 cDNA Brn3b 및 Pax6위한 생산 밴드 덜 견고했다 얼룩. 이러한 PCR 결과에도 불구하고, 이건 정말 차선 B, C, D 및 E에서와 같이 cDNA 나왔는 Affymetrix 배열에 강력한 hybridizations을 양보하지 않으며 일반적으로 피해야하는 우리의 경험이다. photoreceptor 마커 Crx위한 유전자 특정 PCR은 단세포 cDNAs (그림 3B)의 오염 수준을 결정하는 데 사용되었다. 이러한 세포 따라서 망막의 대부분 (~ 70 %) 메이크업하고 있기 때문에 photoreceptor 표지가 선정되었다 발생한 세포 용해는 대부분 막대 photore을 수반ceptors. Crx 선물의 희미한 금액도 PCR의 30 사이클 이후에 이러한 cDNA 준비에만 발생했습니다. 마지막으로,이 PCR 기반 화면 cDNAs가 전체 microarray 프로 파일링에게 쓰는 전에에서 파생되었다 특정한 세포 유형의 어떤 하위 집합 결정하기 시작하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은이 과정에서 가장 비싼 단계로 프로파일되는 세포의 우선 순위를하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 유전자 Tachykinin1 (그림 3B)의 존재 그들을 상영하여 망막 신경절 세포의 일부가 확인되었습니다. 작은 PCR 기반의 화면에서 특정 단일 세포는 선택과 cDNAs은 Affymetrix microarray에 hybridized됩니다. microarray 데이터 비교 및​​ 패턴은 표준 클러스터링 알고리즘을 사용하여 발견 할 수 있습니다. 같은 그림 4에서와 같이 Heatmaps는, 그래픽 데이터를 표현하기 위해 생성됩니다. 그림에서 단일 세포 프로 파일링 데이터와 관련된 두 가지 주요 결론이 있습니다4. 단세포 프로토콜을 수행한 후에는 먼저, 특정 세포 유형으로 표현 유전자는 해당 셀 유형에서 거의 독점적으로 발견된다. 한 셀 타입의 마커 유전자는 바이폴라 세포가 두 번째 셀 타입에서이 표현은 쉽게 원위치에 하나에 의해 확인되어, 낮은 수준의 일부 &quot;로드&quot;유전자를 표현하는 등 관찰과 같은 두 번째 셀 타입, 또한 발견되는 대부분의 경우에서 하이브 리다이 제이션이나 항체 염색법. 둘째, 다양 amacrine와 신경절 세포 프로파일 내에서 유전자 발현의 이질 즉시 명백한 것입니다. Nr4a2 및 Scube2 다른 amacrine 세포 heterogeneously 표현 유전자의 두 예입 동안 Pou4f1는, 개발 신경절 세포 1 / 4 정도 표시됩니다. 수백 개의 유전자가 개발 신경절 세포의 마커로서 혹은 2,4 amacrine 세포의 다양한 인구의 마커로서 식별 및 확인되었습니다대로 실제로, 히트맵에 표시된 유전자는 작은 샘플입니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> 1 그림. 단일 세포 프로 파일링 방법의 흐름도. 우선 망막는 고립된 papain을 사용하여 각각의 세포에 dissociated 있습니다. 둘째, 단일 세포 뽑아 유리 바늘로 채취 및 PCR 튜브로 입금됩니다. 세포 lysed 및 cDNA는 PCR 다음에 역방향 전사를 사용하여 증폭하고 있습니다. 결과 cDNA 품질 등의 표시 것과 아가로 오스 겔에서 평가됩니다. 첫 번째 차선의 DNA를 사다리 후 차선 미디어 컨트롤에서 증폭 제품과 번갈아 단일 세포 (빨강 괄호로 표시)에서 cDNA 얼룩을 보여줍니다. 이러한 품질 (적색 브래킷)의 번진 자국은 Affymetrix의 microarrays에 hybridized됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> 그림 2. 바늘 및 흡인기 튜브 어셈블리의 사진. 단일 세포의 모세관을 사용하여 절연하고유리 micropipette을 (내경 0.5 mm, 외경 1.04 ㎜) 당겼고, 흡인기로 불어의 압박에 의해 전송됩니다. 이것은 흡인기 튜브가 모두 긴 쉽게 조작할 수있을만큼 안정적으로 개별 세포를 배출 정도로 짧은 것이 중요합니다. 바늘로 뽑았 모세관 튜브의 클로즈업 전망 B.에 나와 있습니다 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> 그림 3. 단세포 cDNA 나왔 및 유전자 특정 PCRs의 대표 예. 증폭 후 cDNA 단일 세포의 품질을 확인하려면, 각각 하나의 세포 샘플의 10 μl는 부정적인 컨트롤 ()와 함께 1 % 아가로 오스 겔에서 실행되었다. 얼룩은 500-2000 BP 사이에 나타납니다. 특정 유전자에 대한 추가 PCR 기반의 심사를 식별 / 격리되었다 세포의 종류와 샘플의 오염 선물의 양을 (B)를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 망막 신경절 세포에 대한 특정 Primers는 Brn3b를 마커그리고 Pax6은 이러한 세포 (행 1 및 2)의 신원을 확인하는 테스트되었습니다. 준비 photoreceptor 오염의 양을 평가하기 위해 photoreceptor 마커 Crx 특정 primers는 (행 3) 사용되었습니다. 신경절 세포의 하위 집합은 또 Tachykinin1 (행 4)와 같은 마커에 대한 심사를 통해 확인할 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> 4 그림. 마커 유전자의 단일 세포 표현식은. 22 별개의 단일 세포로 표현 선택된 유전자의 microarray 결과 히트맵 형식으로 표시됩니다. microarray 신호의 농도는 붉은 색의 강도와 일치하도록 조정되었습니다. 블랙 microarray에 대한 신호의 부재를 나타냅니다. 다른 세포는 성인 망막으로부터 격리하는 동안 표시되는 망막 신경절 세포 (RGC) 엽 성의 전구 물질은 배아 시간 지점에서 고립되었다.

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O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+normally+incompatible+developmental+pathways+in+retinoblastoma+genesis.">Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis.</a> Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Ginsberg, S. D., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+analysis+within+the+human+hippocampus:+comparison+of+CA1+and+CA3+pyramidal+neurons.">Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons.</a> J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).</li><li>Iscove, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+is+faithfully+preserved+in+global+cDNA+amplified+exponentially+from+sub-picogram+quantities+of+mRNA.">Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.</a> Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).</li><li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level.">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18 (2006).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

연구를 계속 확장하는 숫자는 그들의 유전자 발현 6,8에 관한 더 균질로 생각되었다 인구에 강력한 휴대 전화의 변화를 공개하고 있습니다. 적어도 하나의 인스턴스에서이 유전자 발현 &quot;노이즈&quot;가 중요한 생물 학적 기능 13 재생을 보여줘왔다. 개별 세포 간의 유전자 발현 차이는 전통적인 전체 - 조직 방법을 사용하여 왜곡하고 있습니다. 이러한 실험 대표 14되지 ?...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

세포의 고도로 전문화된지만, 상당히 작고 인구는 많은 조직에서 중요한 역할을 재생합니다. 극히 드문 셀 하위 집합에 대한 셀 타입의 특정 마커와 유전자 발현 프로그램의 식별은 표준 전체 - 조직 접근법을 사용하여 도전하고있다. 개별 세포의 유전자 발현 프로 파일링은 전체 조직을 1-7의 단지 작은 백분율을 구성하는 세포 유형에 대한 전례없는 접근을 허용합니다. 또한,이 기법은 transiently 역동적인 발달 전환 8시 세포의 작은 숫자로 표현되는 유전자 발현 프로그램을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 세포의 다양성이 문제의 연결을 연결 9 상당히 다양한 세포 사이에 발생할 수있는 중추 신경계 (CNS)에 반복적으로 발생합니다. 서로 다른 세포 유형의 정확한 숫자는 정확하게 알려져 있지 않지만 그것은 내가 피질에있는 많은 1000 가지 종류가있을 수 있다고 추산되었습니다tself 10. 복잡한 신경 회로의 기능 (들)은 희귀의 연결 유형과 그들이 표현하는 유전자의 일부에 의존하고 있습니다. 새로운 마커를 확인하고 molecularly 다른 뉴런을 분류하는 데 도움함으로써 단일 셀 접근 방식은 신경계의 세포 유형의 분석에 특히 유용합니다. 그것은 또한의 연결을 시조 개발의 초기 단계 동안 differentially 표현 유전자와 유전자 경로를 식별하여 신경 발달의 메커니즘을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다. 상당한 다양성의 연결을 가진 간단하고 쉽게 접근할 조직으로 척추 망막 세포 발달의 연결을 분화하고의 연결을 다변화의 과정을 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그러나 CNS의 다른 부분에서와 같이,이 세포 다양성로드 photoreceptors가 교장 이루는 것을 특히 주어진 특정 세포의 운명을 채택 망막 progenitors을 유발 유전자 경로를 결정하는 문제를 제시할 수총 망막 세포 인구 11 jority. 여기 하나의 망막 세포 (그림 1)로 표현 성적표의 확인에 대한 방법을보고합니다. 단일 세포 프로 파일링 기술은 망막 2,4,5,12의 다양한 세포 인구 내에서 이질 선물의 금액의 평가를 허용합니다. 또한,이 방법은 세포의 운명은 망막 전구 세포의 하위 집합 8에서 발생하는 프로세스를 의사 결정에 ​​역할 (들)을 재생할 수 있습니다 새로운 후보 유전자의 호스트를 발표했다. 프로토콜에 대한 간단한 조정으로이 기법은 여러 조직과 세포 유형에 활용할 수 있습니다.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K 조회수.  Iowa State University. 단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

비디오: Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토​​를위한 유용한 도구

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Methods Article

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링