Notre protocole décrit l’utilisation d’un biocapteur de peroxyde d’hydrogène dans les neurones et les larves de poissons zèbres cultivés. Ce protocole aidera les chercheurs à disséquer le rôle des espèces réactives de l’oxygène dans la physiologie et la physiopathologie normales. Le principal avantage de cette technique est la détection en temps réel du peroxyde d’hydrogène chez les animaux vivants et les cellules cultivées.
Cette méthode peut être appliquée à d’autres animaux, comme le système de modèle de rongeur. Pour préparer les lamaux de couverture, utilisez des lamelle de couverture nettoyée à l’acide stockée dans de l’éthanol à 100%. Utilisez une pince pour enlever une lame de couverture du contenant d’entreposage et enflammez-la pour éliminer l’éthanol résiduel.
Séchez complètement la lame de couverture en la plaçant à un angle à l’intérieur d’un plat de culture de 35 millimètres. Préparer la Poly-D-Lysine ou le PDL, ou la solution de travail. Appliquez PDL au centre de chaque lamelle de couverture, en évitant l’étalement de la solution sur les bords et incuber le PDL pendant 20 à 30 minutes à température ambiante.
Assurez-vous que le PDL ne se dessèche pas. Lavez le PDL avec 0,5 millilitres d’eau stérile et laissez les plaques sécher complètement. Préparer la solution de travail de laminine.
Et appliquez-le au centre de chaque lamelle de couverture, en vous assurant d’éviter la propagation de la solution sur les bords. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié pendant deux à six heures, éviter un séchage de la solution de laminine. Pour effectuer une dissection d’embryon dans les cellules ganglionnaires rétiniennes de plaque ou RGCs, préparer et étiqueter quatre plats de culture de tissu de 35 millimètres et les remplir avec quatre millilitres d’éthanol à 70%.
E2 media un. E2 media deux. Et E2 media trois, le jour de la dissection.
Gardez la vaisselle au réfrigérateur. Lorsque les embryons de poisson zèbre sont 34 heures après la fécondation, sortez les plats de culture recouverts de laminine de l’incubateur. Et lavez les glissades du couvercle trois fois avec 0,5 millilitres de PBS 1X.
Après le lavage final, ajoutez quatre millilitres de ZFCM+ milieu à chaque plat de culture. Évitez de sécher la plaque. Récupérez les plats de culture réfrigérés préparés et laissez-les équilibrer à la température ambiante.
Remplissez quatre à six tubes PCR avec 15 microlitres de ZFCM+media. Récupérez des embryons de poisson zèbre de l’incubateur et plongez les embryons dans une boîte de culture de tissus de 35 millimètres contenant 70% d’éthanol pendant 5 à 10 secondes pour le stériliser. À l’aide d’un transfert de pipette, transférer des embryons dans le média E2 d’une boîte, contenant un média E2 stérile pour laver l’excès d’éthanol.
Ensuite, transférez les embryons dans le plat E2 media two et retirez leurs chorions avec une pince tranchante. Enfin, transférer des embryons dans le média E2 trois plats pour effectuer des dissections. À l’aide d’une paire de pinces fines, positionnez et maintenez les embryons antérieurs au jaune avec l’une des pinces.
Et retirez la queue postérieure au sac vitellin avec les autres pinces. Prenez le cou avec une pince et enlevez la tête pour exposer le cerveau et les yeux aux médias E2. Avec la pointe de la pince fine, roulez doucement les yeux de la tête tout en maintenant le tissu crânien vers le bas avec une deuxième pince.
Transférer quatre yeux vers l’un des tubes préalablement préparés contenant ZFCM+Triturer doucement de haut en bas avec une pipette p20 environ 45 fois pour dissocier les cellules. Transférer le ZFCM+ avec les cellules dissociées au centre des lamelle. Maintenez les cultures sur la paillaise à 22 degrés Celsius sur un support en mousse de polystyrène pour absorber les vibrations.
Le jour de l’imagerie, vérifiez les cellules au microscope pour valider la croissance des axones RGC. Pour l’imagerie des cellules vivantes, transférez les lamaux de couverture de la parabole de culture vers une chambre d’imagerie des cellules vivantes. Utilisez un microscope inversé équipé d’un filtre rouge OG-590 Longpass objectif DIC et d’une caméra EMCCD.
Avant l’imagerie, remplacez le milieu ZFCM+ par ZFCM-Après avoir positionnement les cellules avec l’objectif 10X, acquérir des images à un grossissement de 60X à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile. Utilisez un grossissement supplémentaire de 1,5 X. Commencez par acquérir des images DIC.
Ensuite, image roGFP2-Orp1, en utilisant le jeu de filtres approprié. Après avoir pris le premier ensemble d’images, échangez des médias avec des médias contenant différentes solutions de traitement. Les supports doivent être changés toutes les 30 minutes d’imagerie pour éviter les changements de pH et d’osmolarité.
Pour l’imagerie in vivo, conservez les embryons post-fécondation de 22 à 24 heures dans un milieu E3, contenant 0,003 % de phényl thiourée sans bleu de méthylène. Échangez des médias et retirez quotidiennement les embryons morts. À l’âge souhaité, anesthésier et monter des embryons dans de l’agarose à 1% sur des plats de culture de fond de verre de 35 millimètres.
Les embryons peuvent être orientés dorsalement, ventralement ou latéralement, selon la région d’intérêt pour l’imagerie. Une fois l’agarose solidifiée, remplissez les plats avec un support E3 sans bleu de méthylène, mais avec 0,016% de tricaine. Configurez le microscope pour l’imagerie.
Utilisez un microscope confocal à balayage laser inversé pour imager des embryons montés sur le fond d’une goutte d’agarose. Exciter roGFP2-Orp1, et acquérir des images correspondantes avec les filtres d’émission souhaités. Acquérir des z-stacks avec cinq micromètres d’épaisseur de section à travers la partie souhaitée des embryons.
Après imagerie, retirer les embryons de l’agarose avec une pince fine et les conserver dans l’incubateur et les milieux libres de bleu de méthylène avec de la phényl thiourée jusqu’à l’âge souhaité. Une image représentative du biocapteur au peroxyde d’hydrogène et des axones étendus RGC de poisson zèbre d’élevage est montrée ici. Le corps cellulaire, axone, et les cônes de croissance sont clairement visibles dans les neurones individuels.
L’ajout de peroxyde d’hydrogène dans les milieux de culture augmente les valeurs de rapport, montrant que des changements en temps réel peuvent être détectés avec ce système. La quantification des niveaux de peroxyde d’hydrogène est présentée dans le panneau B.To déterminer les niveaux de peroxyde d’hydrogène dans les embryons entiers de poisson zèbre, l’ARNm a été injecté au cours de la phase d’une cellule, provoquant tous les tissus à exprimer le biocapteur roGFP2-Orp1. La région de tête des larves de poissons zèbres est représentée à deux moments différents, en se concentrant sur les niveaux de peroxyde d’hydrogène dans la rétine.
Les concentrations basales de peroxyde d’hydrogène dans les embryons de poissons zèbres deux jours après la fécondation et cinq jours après la fécondation ont été mesurées. Deux jours après la fécondation, les valeurs de rapport étaient significativement plus faibles qu’à cinq jours après la fécondation. En outre, chaque animal a montré un niveau différent d’augmentation de leur teneur en peroxyde d’hydrogène rétinien.
L’utilisation de pinces fines pour enlever les yeux et la dissociation douce des yeux avec la pipette sont les étapes les plus critiques de cette procédure. Ce protocole peut être suivi par des traitements médicamenteux pour étudier les facteurs impliqués dans la signalisation ROS.
